Eliana Icochea Laboratorio de Patología Aviar FMV-UNMSM.

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1 Eliana Icochea Laboratorio de Patología Aviar FMV-UNMSM.
Genotipos del virus de la Enfermedad de Newcastle y Experiencias en la Prevencion de la enfermedad Eliana Icochea Laboratorio de Patología Aviar FMV-UNMSM.

2 ETIOLOGIA SUBFAMILIA PARAMIXOVIRINAE Morbillivirus Metapneumovirus
Genero Metapneumovirus FAMILIA PARAMIXOVIRIDAE Morbillivirus Avulavirus SCH ENC

3 Genoma viral: (RNAsd -)
NP HN Nucleocapside F Morfología de los Paramixovirus Genoma viral: (RNAsd -) NP P M F HN L 3’ 5’ Kilobases 1682 1894 1173 1846 1891 6799

4 Enfermedad de newcastle
Económicamente importante APMV=1 La enfermedad clínica observada depende varios factores: Especie de ave Inmunidad del huésped Cantidad de virus a que el huésped es expuesto

5 Casos de Enfermedad de Newcastle FMV=UNMS (1973=2001)
Number of Cases Muestra una presentacion ciclica en la que aumenta y disminuye Here we have the number of cases collected by the avian pathology lab since 1973 thru 2005. Reported year

6 Diagnósticos de ENC en el Lab
Diagnósticos de ENC en el Lab. de Patología Aviar FMV-UNMSM de al (Mora M, 2005)

7 Diagnósticos de ENC en el Lab
Diagnósticos de ENC en el Lab. de Patología Aviar FMV-UNMSM, por estación del año 1990 al 2002 (Mora M, 2005)

8 Diagnósticos de ENC en el Lab
Diagnósticos de ENC en el Lab. de Patología Aviar FMV-UNMSM, por tipo de explotación de 1990 a Septiembre 2005 (Mora M, 2005)

9 Numero de casos de ENC, por tipo de explotación, últimos años al 2013

10 Diagnósticos de ENC últimos años

11 Diagnósticos en Lima Metropolitana
Pachacamac Chincha

12 Signos clinicos

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15 Secuela nerviosa en aves sobrevivientes: opistotonos Observado en aves
con protección

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18 ADULTAS

19 CLASIFICACION DE CEPAS
SEROTIPO VIRAL: (APMV-1) Uno solo PATOTIPO: Lento, meso y velo génico GENOTIPO: Clase I (silvestres) Clase II (domesticas y silvestres)

20 Clasificación de cepas APMV-1
PPMV Patotipo ICPI IVPI MDT Ulster 2C Entérica asintomática 0.0 > 150 Queensland V4 Hitchner B1 Lentogénica 0.2 120 F 0.25 119 La Sota 0.4 103 H Mesogénica 1.2 48 Mukteswar 1.4 46 Roakin 1.45 68 Beaudette C 1.6 62 Texas GB Velogénica 1.75 2.7 55 NY parrot 70181 1.8 2.6 51 Italien 1.85 2.8 50 Milano 1.9 Herts 33/56 2.0 PPMV-1: Palomas

21 Genotipo viral Investigación epidemiológica local y global de los virus de la ENC para diferenciar virus enzoóticos de epizoóticos. Secuenciación de nucleótidos Agrupa cepas dentro de grupos similares, colocándolas dentro de linajes específicos o clades.

22 Genotipos virus ENC Dos clases: I y II
Las cepas de Clase I se aíslan principalmente de las aves silvestres acuáticas y costeras y son generalmente no virulentas, Cepas de clase II circulan en aves domésticas y silvestres, (Cao, Yong, et al, 2013; Courtney SC, et al, 2013).

23 Genotipos de virus de la ENC
vENC un solo serotipo pero diversidad genética: Longitud del genoma (15,186, 15,192 o 15,198 nt) Secuencia de nucleótidos: Clase I Genotipo Tipo ave Virulencia I Silvestres Baja (exc Irlanda 90) Clase II Baja (exc Aus 98) II B1, La Sota, VG-GA III-IX Virulentas X domesticas Baja XI-XVI

24 Clasificación de cepas en linajes (Diel DG,et al, 2012)
Se realizo un estudio de evaluación de la diversidad genética de los paramixovirus aviar tipo 1 (APMV-1). Se realizó la reconstrucción filogenética de las secuencias completas del gen F de 110 cepas de virus de la clase I y 602 cepas de virus de clase II.

25 Genotipo de una cepa del virus de la ENC aislada en Perú en el año Tomado parcialmente de: A: no clasificado (Diel, D.G et al, 2012), B: Genotipo XII (Courtney SC, y col, 2013)

26

27 Caracterización biológica y molecular de cepas del virus de la ENC aisladas en Perú
Ana Chumbe1, Ray Izquierdo1, Luis Tataje1, Carla Perinango1, Karen Segovia2, Rosa Gonzalez2, Giovana Cribillero2, Francesca Falconi1, Manolo Fernández1, , Eliana Eicochea2 1FARVET S.A.C. Carretera Panamericana Sur Nº 766 Km 198.5, Chincha Alta. Ica – Peru. 2Laboratorio de Patología Aviar, Facultad de Medicina Veterinaria.UNMSM. Lima- Peru.

28 Muestras años 2004 al 2011 15/34 cepas para IPIC 3 silvestres
12 domEsticas

29 Caracterización biológica y molecular
Índice de Patogenicidad intracraneana Determinación del genotipo: Genotipificacion de la secuencia del gen de la proteína de Fusión. IN BIOSAFE LEVEL THREe facility at Farvet. Genotyping based on Fusion gene sequence to determine genotypes

30 9 day-old embryonated SPF chicken eggs
Método ICPI (BSL3) Pool samples HA RT-PCR Dx of NDV HA >24 IH Storage -80°C 9 day-old embryonated SPF chicken eggs First was developed hemaglutination and then inhibition of hemaglutination Amplification F gene Genetic Distance Phylogeny

31 Resultados Combate/Barranco-Lima/2004 30/09/04 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4
Sana 2 Enferma 8 Muerta 10 ICPI=1.85 0.8 combate/lavictoria-Lima/2006 22/11/04 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4 Dia5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Sana 3 Enferma 7 Muerta 10 ICPI=1.84 0.7 2 postura/Lurin-Lima/2004 04/10/04 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4 Dia5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Sana 10 Enferma Muerta ICPI=0 broiler/Apurimac/2005 04/01/05 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4 Dia5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Sana 8 Enferma 2 Muerta 10 ICPI=1.78 0.2 combate/Lurin-Lima/2004 26/10/04 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4 Dia5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Sana 6 Enferma 4 Muerta 10 ICPI=1.75 0.4 1.6 2 broiler/Piura/2006 25/01/06 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4 Dia5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Sana 4 Enferma 6 Muerta 10 ICPI=1.83 0.6 2 broiler/cercado-Lima/2004 20/10/04 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4 Dia5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Sana 10 Enferma 5 Muerta ICPI=1.69 1.5 2 Pavo real/SanMiguel-Lima/2011 05/11/11 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Day 4 Dia5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Sana 5 Enferma 1 Muerta 9 10 ICPI=1.8 0.5 1.9 2

32 1 Cepa Fecha Procedencia Especie ICPI 02/2009 Puerto Viejo
 02/2009 Puerto Viejo Anas bahamensis 2 17/02/2009 3 07/07/2009 Gaviota gris 4 04/10/2004 Lurin Postura 11 sem 5 20/10/2004 Lima Pollos de engorde 1.688 6 26/10/2004 Gallos de pelea 1.75 04/01/2005 Apurimac Pollos engorde 1.775 7 09/03/2011 Rimac 8 28/04/2011 Huachipa 9 08/04/2011 Huaral 1.8 10 11/05/2011 Pavo Real 11 25/01/06 Piura ponedoras 1.825 12 22/11/04 La Victoria Gallo de Pelea 1.838 13 30/09/2004 Barranco Rina 8 meses 1.85 14 16/08/2004 Pollos criollos 45 dias 1.875

33 Genotipificacion

34 Genotipificacion (9 cepas)
Muestras ICPI Sequenciamiento Ponedora/Lurin-Lima/2004 ok broiler/cercado-Lima/2004 1.69 Doble peak combate/Lurin-Lima/2004 1.75 broiler/Apurimac/2005 1.78 Pavo real/SanMiguel-Lima/2011 1.80 broiler/Piura/2006 1.83 combate/lavictoria-Lima/2006 1.84 combate/Barranco-Lima/2004 1.85

35 Secuencia gen Fusion (Cleavage Site) de 8 cepas
aa sequence position 112 113 114 115 116 117 Samples ICPI GGG AGA CAG CGC CTT Postura comercial/Lurin-Lima/2004 Gly Arg Gln Leu AGG AAA TTT Combate/Lurin-Lima/2004 1.75 Lys Phe Pollo engorde/Apurimac/2005 1.78 CAA Pavo real /SanMiguel-Lima/2011 1.80 Pollo de engorde/Piura/2006 1.83 Combate/lavictoria-Lima/2006 1.84 Chicken-fightingbird/Barranco-Lima/2004 1.85 112R-R-Q-K-R-F117 Concordancia entre las dos pruebas

36 VII V VIII VI XIII XIV XII-gi| |Goose/China XII-gi| |gb|Goose/China XII-gi| |gb|Goose/China Peacock-pet/SanMiguel-Lima/2011 XII poultry/Peru/2008 Chicken-fightingbird/Barranco-Lima/2004 Chicken-broiler/Apurimac/2005 Chicken-fightingbird/lavictoria-Lima/2006 Chicken-broiler/Piura/2006 XV IX XI IV III I X II-gi| |gb|EU | II-gi| |gb|AF | II-gi| |gb|EU | II-gi| |gb|AY | II-gi| |gb|AF | Chicken-Laying/Lurin-Lima/2004 100 97 76 93 99 94 78 81 69 98 91 70 96 68 80 0.02 Phylogenetic analysis based on the complete nucleotide sequence of the F gene. XII Chicken-fightingbird/Lurin-Lima/2004 The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method [1]. The optimal tree with the sum of branch length = is shown. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches [2]. The tree is drawn to scale, with branch lengths in the same units as those of the evolutionary distances used to infer the phylogenetic tree. The evolutionary distances were computed using the Maximum Composite Likelihood method [3] and are in the units of the number of base substitutions per site. The rate variation among sites was modeled with a gamma distribution (shape parameter = 0.5). The analysis involved 118 nucleotide sequences. All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 1647 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA6 [4 II

37 Similaridad cepas Velogenic agrupadas en el genotipo XII
Muestras del 2004 to 2006 asociadas Cepa pavo real del 2011 estrecha relacion con cepa 2008. Cepa lentogenica genotype II.

38 Conclusiones Once de catorce cepas tuvieron un ICPI mayor a 1.6 indicando que la mayoria de cepas que circularon en Peru del 2004 al 2011 son cepas virulentas (Aves de combate, pollos de pequenas granjas). Las cepas virulentas pertenecen al genotipo XII La cepa no virulenta genotipo II Las de las silvestres al genotipo I Una cepa de ponedorass fue lentogenica (ICPI = 0) El secuenciamiento detecto mas de una cepa en una de las muestras..

39 Vacunación contra la Enfermedad de Newcastle
No evita la infección Vacunas disminuyen numero de aves infectadas y eliminacion al ambiente. Previenen signos, lesiones, morbilidad y la mortalidad. Aumente la cantidad de virus necesaria para infectar al animal vacunado.

40 Vacunación contra la Enfermedad de Newcastle
V. vivas Inducen inmunidad mucosal, causan reacción respiratoria disminuyendo el crecimiento. Vacunas inactivadas con adyuvantes inducen inmunidad mucosal (quitosan) Tendencia a usar en pollos de engorde vacunas menos reactivas. Brotes en poblaciones vacunadas: + Ponedoras

41 Vacunas vivas contra ENC
Tipos de vacuna Lentogénicas B1 Hitchner La Sota F Entéricas VG-GA PHy-LMV42 Termoestables I-2 V4 -HR Vectorizadas HVT-ND MSD Ceva Genética reversa México, Indonesia

42 Evaluacion vacunas entericas
Edad dias Vacuna viva (Una) Vacunas vivas (dos) inactivada / viva Control A n=40 B C D E F G 1 8 14 18 28 29-46 Inact/Oil VG GA PHY.L MV 42 Clone 30 VGGA No vac IBD Desafio Registro de signos clinicos, mortalidad, lesiones

43 Mortalidad a 46 ( 18 dias post desafio)
Control unvacc F inactiva Clone 30 E intesti D intesti (2) C B intesti A intesti 62.5 0.0 2.5 % 25/40 0/40 1/40 TOTAL

44 Desafío 28 días de edad (60uL ocular 107.8 DIE 50)
Viva Días 1 y 9 Inactivada Día 1 Viva Día 9 HVT/ND Viva: Dia 1 Control Mortalidad 12.5 18.4 2 100 Secuelas nerviosas 8.3 10.2 6.2 ND

45 Comparación dos vacunas vectorizadas
Vectorizada A Viva Vectorizada B Mortalidad % 10 6.6 Aves con secuelas nerviosas 1 Desafío 28 días con 60 uL vía ocular de cepa con 10 7 DIE 50

46 Vacuna entérica vía subcutánea y spray al día 1 de edad
Grupo 1 Grupo 2 Entérica Spray y subcutánea Sin vacuna

47 En Perú vacunación obligatoria de aves domesticas.
Vacunacion En Perú vacunación obligatoria de aves domesticas.

48 Respuesta serológica (PGT) vacunación HVT/ND, ELISA Idexx
Motoyuki Esaki et al, 2013

49 Respuesta serológica post desafío
Respuesta serológica pre desafío Inactivada y entérica al día 1 Pre reto 26 días Vectorizada y entérica 1 Pre reto 26 días Respuesta serológica post desafío

50 Inicio de protección por HVT/ND post desafío respiratorio
Grupo Protección 1 sem 2 sem 3 sem 4 sem 5 sem HVT+SB1 HVT/ND + SB1 10 60 90 100 Protección mortalidad, actividad HA y lesiones de embriones inoculados con hisopados tráquea Motoyuki Esaki et al, 2013

51 Aplicación vacunas vivas
Spray o aerosol: Crucial tamaño de la partícula, muy pequeña: reacción respiratoria y muy grande virus no logra infectar al ave. Pollos de 1 día con anticuerpos maternales son mejor inmunizados por aerosol que con vacunación al agua. Uniformidad de respuesta.

52 Inmunidad grupal

53 Teoría epidemiológica
Si 1 individuo puede infectar mas de 1 individuo: epidemia. Inmunidad de grupo se logra si una alta proporción de las aves (85%) tienen un título de anticuerpos elevado (Titulo HI 3 log2) después de la vacunación.

54 Estudio de transmisión horizontal
Exp Vacuna Spray Edad (Dias) Desafío 22 a 26 d HI Titulo log2 Numero de aves en contacto Infectado* Muertos 1 La Sota NL93 (106) 0 a 2 9/10, 10/10 0,1 2 Hertz (106) 5/10 3 California (106;4) 10/10 4 Ulster 1 y 8-20 NL93 (103.8) 10/10, 10/10 4,4 5 NL93 (106) ≥ 3 010,4/10,10/10 0,0,0 6 0/10, 2/10 0,0 7 1/10, 3/10 8 7/10 * Signos clinicos o incremento del titulo al menos 2 log

55 Aplicación de vacunas vivas
Efectivas si correctamente aplicadas y si se da el tiempo para dar una respuesta protectiva antes de la exposición. Al agua: efectividad depende de inactivación por calor, impurezas y consumo de agua B1/La Sota 1 y 21 Ocular Spray Agua de bebida HI (titulo log2) 6.6 5.9 Proteccion 93,3 % 53% 60% Degefa T y col, 2004, J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med Efectividad depende estado de inmunosupresión de las aves. (Experimentos mejores resultados que en campo)

56 Títulos protectores Resultados de campo sugieren que sólo aves con títulos HI ≥ 16 después de múltiples vacunaciones sobrevivirán un reto vNDV (Kapczynski y King, 2005). Niveles de HI de 32 o más son protectores (Allan et al., 1978).

57 Vacunas ENC por Genética reversa
Usa cepas virulentos de genotipo prevalente Mejor protección de genotipos homólogos. Disminuir la eliminación viral Xiao S, et al. (2012) Reverse Genetics Based on Highly Virulent Indonesian Strain.

58 Gracias