ADAPTACION DEL METODO DE REFERENCIA DE LA HEMOGLOBINA EN SANGRE TOTAL PARA LA CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA LIBRE EN SUERO M. P. Fernández (1), M.A. Llopis.

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1 ADAPTACION DEL METODO DE REFERENCIA DE LA HEMOGLOBINA EN SANGRE TOTAL PARA LA CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA LIBRE EN SUERO M. P. Fernández (1), M.A. Llopis (2), C. Biosca (3), G. Busquets (4), M.V. Doménech (5), M. Ibarz (6), M I. Llovet (7), R.M. Pastor (8), C. Perich (9), R. Ruiz (10), M. Montesinos (4), M. J. Alsina (2), V. Álvarez (10), J. Minchinela (2), M. Simón (11), E. Tarrés (12). (1) Laboratoris Clínics Hospital Vall d'Hebron, Barcelona, (2) Laboratori Clínic Barcelonès Nord i Vallès Oriental, Badalona, (3) Servei Bioquímica Clínica Hospital Germans Trias i Pujol, Badalona, (4) Laboratori Clínic Hospital Universitari Dr. Josep Trueta, Girona, (5) Laboratori Clínic Manso, Barcelona, (6) Laboratori Clínic Arnau de Vilanova, Lleida, (7) Laboratori Clínic Hospital Verge de la Cinta, Tortosa, (8) Laboratori Clínic Joan XXIII, Tarragona, (9) Laboratoris Clínics Bon Pastor, Barcelona, (10) Laboratoris Clínic L'Hospitalet, L'Hospitalet del Llobregat, (11) Consorci de Laboratori Intercomarcal Anoia, Penedès i Garraf , Vilafranca del Penedès, (12) Laboratori Cínic Berguedà, Berga. INTRODUCCION Actualmente, la mayoría de los analizadores ofrecen una estimación semicuantitativa del nivel de hemólisis mediante mediciones de absorbancia a distintas longitudes de onda (). El método de referencia para cuantificar hemoglobina es el de cianometahemoglobina. Este método utiliza ferricianuro potásico y cianuro potásico para transformar la hemoglobina en cianometahemoglobina (máx540 nm). Está estandarizado para cuantificar concentraciones de hemoglobina en sangre total pero no resulta útil para cuantificar la concentración de hemoglobina libre en suero. OBJETIVO Adaptar el método de la cianometahemoglobina para la cuantificación de concentraciones de hemoglobina en suero, liberada durante el proceso de hemólisis, para preparar una serie de estándares de una concentración conocida de hemoglobina, dentro del intervalo de 0 a 10 g/L. MATERIAL Y METODOS Para la puesta a punto del método se utilizó un espectrofotómetro UV- VIS (Schimadzu) con selección de  a 540 nm. Se empleó reactivo de Drabkin (SIGMA), Solución Brj 35 como detergente no iónico (SIGMA) y hemoglobina humana (SIGMA). La curva de calibración de (0-10) g/L se preparó a partir de un estándar de concentración de hemoglobina humana de 20 g/L y utilizando como diluyente solución Drabkin’s. Se diluyó esta solución de hemoglobina de 20 g/L con solución Drabkín’s, de manera que la absorbancia de la disolución resultante se ajustase al margen de absorbancia con mayor sensibilidad de medición del espectrofotómetro, a la  de interés. La misma dilución se aplicó a las muestras. La dilución apropiada para esta curva de calibración fué 1:12 (250 µL de solución de hemoglobina 20g/L con solución Drabkin’s hasta 3 mL). A partir de esta solución de cianometahemoglobina diluida se hicieron diluciones seriadas con la solución Drabkin’s para obtener la curva de calibración con estándares de (0, 2.5, 5,10) g/L de hemoglobina humana. Una de las limitaciones de la utilización de esta curva fué la falta de sensibilidad para concentraciones inferiores o iguales a 1 g/L, por ello se preparó otra curva de calibración de (0-2) g/L . Para su preparación la dilución apropiada fué 1:2.5 (1.2 mL de solución de hemoglobina 4 g/L con solución Drabkin’s hasta 3 mL). A partir de esta solución de cianometahemoglobina diluida se hicieron diluciones seriadas con la solución Drabkin’s para obtener la curva de calibración con estándares (0, 0.25, 0.5, 1,2) g/L de hemoglobina humana. Se evaluó la imprecisión mediante el estudio de la repetibilidad (CV intra-día) y reproducibilidad (CV inter-día) de dos muestras de diferente grado de hemólisis. Para el estudio de la repetibilidad se realizaron diez mediciones de cada muestra, en la misma serie analítica. Para el estudio de la reproducibilidad se realizó una medición diaria en diez días diferentes, durante dos semanas, calibrando diariamente. Para evaluar el límite de detección (LD) y el límite de cuantificación (LQ) se realizaron 20 medidas, dentro de la misma serie analítica, de una muestra de suero fisiológico. RESULTADOS La representación gráfica de las curvas de calibración empleadas para la puesta a punto del método fue la siguiente: La concentración media de hemoglobina y el CV intra-día de las muestras utilizadas para el estudio de repetibilidad y reproducibilidad se muestran en la siguiente tabla: Los resultados del LD y LQ, empleando tres y diez veces la desviación estándar, fueron de 0,039 y 0,16 g/L, respectivamente R2=0.9973 R2=0.9993 [Hb] (g/L) CV intra-día (%) CV inter-día (%) 1,8 5,7 9,7 8,5 3,5 7,7 CONCLUSIONES - Para la cuantificación de la hemoglobina comprendida en el rango de concentraciones (0-10) g/L se requiere el empleo de dos curvas de calibración diferentes - La curva de calibración (0-2) g/L nos permite obtener unos límites de detección y cuantificación adecuados para medir concentraciones de hemoglobina < 1 g/L. La imprecisión del método de cianometahemoglobina adaptado para la determinación de hemoglobina liberada durante el proceso de hemólisis es aceptable para el objetivo planteado.