Análisis y anotación de genomas

Presentación del tema: "Análisis y anotación de genomas"— Transcripción de la presentación:

1 Análisis y anotación de genomas
Fernán Agüero April 1, 2017 © Fernán Agüero

2 Primer genoma (eubacteria): Haemophilus influenzae (1995). 1.83 MB
Historia Primer proyecto de secuenciación de un genoma: Escherichia coli (US + Japón). Comenzó en 1992 y terminó en MB Primer genoma (eubacteria): Haemophilus influenzae (1995) MB Primer genoma (archaea): Metanococcus jannaschii (1996). 1.6 MB Primer genoma (eukarya): Caenorhabditis elegans (). XXX MB April 1, 2017 © Fernán Agüero

3 Qué es un genoma? Una colección de genes
que codifican productos proteicos que codifican RNAs pseudogenes regiones no codificantes regulatorias (expresión) estructurales attachment a matriz nuclear mitosis / meiosis elementos repetitivos April 1, 2017 © Fernán Agüero

4 Interpretar la información cruda de secuencia en un marco biológico
Qué es anotar? Agregar información, de la manera más confiable y actualizada que se pueda para describir una secuencia Información asociada a coordenadas genómicas (comienzo..fin), a distintos niveles Interpretar la información cruda de secuencia en un marco biológico April 1, 2017 © Fernán Agüero

5 Dos niveles de anotación
Anotación genómica Dos niveles de anotación Estructural: encontrar genes y otros sitios con relevancia biológica. Armar un modelo del genoma: cada gen/sitio es un objecto asociado a una posición en el genoma Funcional: los objetos son utilizados en búsquedas (y experimentos). El objetivo es atribuir información biológica relevante a los objetos. April 1, 2017 © Fernán Agüero

6 Más niveles de anotación
Organismo: fenotipo: morfología, fisiología, comportamiento, respuestas ambientales Celula: vías metabólicas, cascadas de señalización, localización subcelular. Molecula: sitios de binding, actividad catalítica, estructura tridimensional Dominio Motif Residuo April 1, 2017 © Fernán Agüero

7 De donde proviene la anotación?
Fuentes utilizadas en la anotación: publicaciones que reportan nuevas secuencias reviews que actualizan periódicamente la anotación de familias o grupos de proteínas expertos externos análisis de secuencia April 1, 2017 © Fernán Agüero

8 Anotación genómica Reactant A Product B transcription RNA processing
ab initio gene prediction Genomic DNA transcription Unprocessed RNA RNA processing Mature mRNA Gm3 AAAAAAA Comparative gene prediction translation Nascent polypeptide folding Active enzyme Functional identification Function Reactant A Product B April 1, 2017 © Fernán Agüero

9 Annotation & functional genomics
La anotación del genoma es esencial en el desarrollo de estrategias funcionales (functional genomics) proteome based functional genomics RNAi phenotypes Gene Knockout Expression Microarray April 1, 2017 © Fernán Agüero

10 Anotación: busqueda de genes
Buscar genes en el genoma RNA ribosomal RNAs  BLASTN tRNAs  tRNAscan protein coding ab initio gene prediction  ORFs, codon usage, frecuencia de hexámeros, modelos, etc.) similarity  BLASTX, otros Buscar regiones no codificantes regulatorias ab initio  Gibbs sampling similarity  patterns, profiles repetitivas similarity ab initio En todos los casos  literatura! April 1, 2017 © Fernán Agüero

11 Integrar resultados BLASTX BLASTN RepeatMasker Secuencia genoma
DB BLASTN Secuencia genoma RepeatMasker tRNASCan flatfiles gene prediction Visualización April 1, 2017 © Fernán Agüero

12 Genome annotation: C. elegans
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13 Resumir resultados de análisis
Guardar el reporte crudo de un BLAST (lista de hits, alineamientos) es demasiado Prácticamente cualquiera de los análisis que se realizan sobre DNA o proteínas para anotar un genoma pueden resumirse en: secuencia start end cromosoma Este formato básico es la base del formato GFF (Sanger) secuencia metodo programa start end frame score extra Contig1 similarity blastx gi|12345|AF34093 casein kinase ... Contig1 cds glimmer ORF0001; overlap with ORF0002 Contig1 similarity blastn gi|54321|AF09990 complete genome April 1, 2017 © Fernán Agüero

14 Anotación: herramientas
Artemis Permite visualizar secuencia, con sus traducciones virtuales (6) tracks de anotación (entries) plots (built-ins y creados por el usuario) Lee secuencias en formato FASTA, EMBL, GenBank Lee features en formato EMBL, GenBank, GFF, MSPcrunch, BLAST April 1, 2017 © Fernán Agüero

15 Artemis: main window Sequence view Sequence view Feature list
April 1, 2017 © Fernán Agüero

16 AA properties plot para un CDS
Artemis: plots %GC plot AA properties plot para un CDS April 1, 2017 © Fernán Agüero

17 Artemis: display de análisis
Frameplot BLASTX BLASTN April 1, 2017 © Fernán Agüero

18 Artemis: April 1, 2017 © Fernán Agüero

19 Artemis: zoom April 1, 2017 © Fernán Agüero

20 Artemis: spliced genes
April 1, 2017 © Fernán Agüero

21 Artemis: comparar análisis
April 1, 2017 © Fernán Agüero

22 En genomas más grandes, la tendencia es a distribuir la anotación
Otras estrategias Artemis se usa para anotar genomas bacterianos o para pequeños proyectos (cósmidos, BACs, etc.) En genomas más grandes, la tendencia es a distribuir la anotación Los tracks de anotación son generados en distintos centros Ejemplo: UCSC Genome Browser (genoma humano, ratón). April 1, 2017 © Fernán Agüero

23 Anotación automática: TrEMBL
La anotación de TrEMBL (translated EMBL) se hace por métodos automáticos. Requerimientos para anotar automáticamente Una base de datos de referencia bien anotada (ej. Swissprot) Una base de datos que sea altamente confiable (en el sentido diagnóstico) en la asignación de proteínas a grupos o familias (ej CDD, InterPro) Una serie de reglas de anotación April 1, 2017 © Fernán Agüero

24 Transferencia directa de anotación
Realizar una búsqueda en la base de datos de referencia y transferir la anotación Ejemplo: FASTA contra una base de datos de secuencias y transferencia de la línea DE del mejor hit XDB Target April 1, 2017 © Fernán Agüero

25 Anotación a partir de múltiples fuentes
Generalmente se usa más de una base de datos externa Hay que combinar los resultados XDB Target April 1, 2017 © Fernán Agüero

26 Conflictos Contradicción Inconsistencia Sinónimos Redundancia
April 1, 2017 © Fernán Agüero

27 Traducción de anotaciones
Es necesario utilizar un traductor para mapear el lenguaje utilizado en la base de datos externa (XDB) al lenguaje utilizado en la base de datos target que queremos anotar XDB Target April 1, 2017 © Fernán Agüero

28 Traducciones: algunos ejemplos
ENZYME TrEMBL CA L-ALANINE=D-ALANINE CC -!- CATALYTIC ACTIVITY: L-ALANINE= CC D-ALANINE. PROSITE TrEMBL /SITE=3,heme_iron FT METAL IRON Pfam TrEMBL FT DOMAIN zf_C3HC4 FT ZN_FING C3HC4-TYPE April 1, 2017 © Fernán Agüero

29 Requerimientos de un sistema de anotación automática
Corrección Escalable Actualizable Poco redundante Completo Vocabulario controlado April 1, 2017 © Fernán Agüero

30 Cómo funciona? Una proteína en TrEMBL es reconocida como un miembro de cierto grupo o familia de proteínas Este grupo de proteínas en Swissprot comparten entre sí partes de la anotación La anotación común es transferida automáticamente a la proteína en TrEMBL y marcada como ‘annotated by similarity’ April 1, 2017 © Fernán Agüero

31 Anotación: evidencias
Las anotaciones suelen estar acompañadas de TAGS que indican la evidencia en la que se basa la anotación Ejemplos de algunos TAGS utilizados en TrEMBL: EMBL: la información fue copiada del original (EMBL/GenBank/DDBJ) TrEMBL: anotación modificada para corregir errores o para adecuarse a la sintaxis propia de Swissprot Curator: juicio del curador Similarity: por similitud con otra secuencia, a juicio del curador Experimental: evidencia experimental de acuerdo a una referencia, que usualmente es un paper. Opinion: opinión emitida por el autor de una referencia, usualmente con poca o ninguna evidencia experimental Rulebase: información derivada del uso de una regla de anotación automática SignalP: programa de predicción April 1, 2017 © Fernán Agüero

32 Anotación: manual vs automática
La anotación de un genoma ocurre en etapas anotación automática correr todos los análisis sobre el genoma generar un primer borrador con todos los datos organizados. Por ejemplo en páginas web o integrando todos los datos en un display unificado (Artemis) anotación manual: cura de los datos una persona (curador) revisa la anotación, gen por gen, verificando la anotación automática, agregando anotaciones manuales, corriendo eventualmente algún programa particular April 1, 2017 © Fernán Agüero

33 Qué herramientas se usan?
Oakridge Genome Annotation Channel ENSEMBL Artemis GeneQuiz Genome browsers: varios cada consorcio/proyecto desarrolló el suyo: Apollo (FlyBase, Drosophila), AceDB (C. elegans), April 1, 2017 © Fernán Agüero

34 Anotación: fuentes de error
Transferencia transitiva de anotaciones gen1 mal anotado como ‘casein kinase’ presente en los bancos de datos gen2 con alta similitud con gen1, resulta anotado como casein kinase Solución: usar bases de datos curadas: por ejemplo Swissprot revisar la anotación de más de un hit verificar que las anotaciones de todos los hits concuerden April 1, 2017 © Fernán Agüero

35 Anotación confiable: proyecto HAMAP
High-quality Automated Microbial Annotation of Proteomes Swissprot (Swiss Bioinformatics Institute-European Bioinformatics Institute) CNRS Lyon INRIA Grenoble INRA Toulouse CNRS Marseille Pasteur Institute April 1, 2017 © Fernán Agüero

36 HAMAP Hay muchos genomas bacterianos terminados, pero va a haber muchos más en los próximos años El número de proteínas bacterianas proveniente de estos genomas llegará al millón muy rápidamente Pero el análisis funcional y una caracterización detallada van a exsitir sólo en unos pocos casos: todas las proteínas de organismos modelo (E. coli, B. subtilis) proteínas involucradas en patogénesis (interés médico e industrial) proteínas involucradas en vías metabólicas específicas (interés biotecnológico) April 1, 2017 © Fernán Agüero

37 Prioridades del proyecto HAMAP
Anotación de proteínas huérfanas Pre-anotación de proteínas pertenecientes a familias grandes/complejas (transportadores ABC, HTH, sistemas de dos componentes, SDH) Anotación de alta calidad de proteínas pertenecientes a familias bien caracterizadas Anotación manual de proteínas caracterizadas experimentalmente en ese organismo Anotación manual de proteínas no caracterizadas que muestren similitud con otras proteínas April 1, 2017 © Fernán Agüero

38 Estrategia HAMAP ORFans April 1, 2017 © Fernán Agüero

39 No tienen hits contra InterPro (Prosite, PRINTS, Pfam, ProDom, SMART)
HAMAP: ORFans No tienen similitud con otras proteínas (excepto tal vez otras proteínas de organismos muy cercanos) No tienen hits contra InterPro (Prosite, PRINTS, Pfam, ProDom, SMART) Qué se hace: Predicción de señales Predicción de regiones trans-membrana Predicción de coiled-coils Anotación de repeticiones April 1, 2017 © Fernán Agüero

40 HAMAP: ORFan antes April 1, 2017 © Fernán Agüero

41 HAMAP: ORFan después April 1, 2017 © Fernán Agüero

42 HAMAP: large/complex families
April 1, 2017 © Fernán Agüero

43 HAMAP: anotación automática
Transferencia automática de anotación Usando reglas específicas para cada famila de proteínas Usando reglas específicas para un organismo particular La transferencia de anotación puede ir acompañada de advertencias para el curador Por ejemplo: WARNING: this genome contains MF_00031 (ruvA) but not MF_00016 (ruvB) April 1, 2017 © Fernán Agüero

44 HAMAP: ejemplo reglas April 1, 2017 © Fernán Agüero

45 HAMAP: Escherichia coli
De acuerdo al análisis original: 4286 proteínas 60 proteínas no detectadas (casi todas < 100 aa) 120 muy probablemente no existan 50 pares o tripletes de ORFs tuvieron que ser fusionados 719 con errores en la asignación del codón de inicio ~1800 todavía sin caracterización bioquímica (aproximadamente una asignación funcional por semana) April 1, 2017 © Fernán Agüero

46 Chromosome browsers UCSC Genome Browser Annotation tracks
provee un display rápido de cualquier región genómica con varios “tracks” de anotación alineados al genoma Por el momento sólo: Human & Mouse Annotation tracks genes conocidos (RefSeq, GenBank) predicted genes (Genscan, FGENESH, GeneID, Acembly) spliced ESTs CpG islands assembly gaps cobertura bandas cromosómicas elementos repetitivos etc April 1, 2017 © Fernán Agüero

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48 UCSC sólo genera la mitad de los tracks
UCSC Genome browser UCSC sólo genera la mitad de los tracks El resto proviene de la comunidad biomédica El Genome Browser es una herramienta de visualización No saca conclusiones! Simplemente integra en forma gráfica toda la información que posee sobre una región, dejando la exploración y la interpretación al usuario. April 1, 2017 © Fernán Agüero

49 UCSC Genome Browser: gene expression
April 1, 2017 © Fernán Agüero

50 UCSC Genome browser: alternative splicing
April 1, 2017 © Fernán Agüero

51 UCSC Genome browser: complex transcription
April 1, 2017 © Fernán Agüero

52 UCSC Genoma browser: user tracks
Ustedes pueden agregar sus propios tracks Pueden ser públicos o privados No necesitan saber programar Tienen que proveer información en formato GFF (u otros similares: GTF, BED) chrom start end [name strand score] chr SP chr SP2 – April 1, 2017 © Fernán Agüero

53 Secuenciación de ESTs de Tupaia belangeri
Ejemplo Secuenciación de ESTs de Tupaia belangeri Mamífero pequeño Bibliotecas de cDNA sustractivas de hipocampo Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702 April 1, 2017 © Fernán Agüero

54 Anotación y clasificación funcional de los ESTs
Anotación ESTs Anotación y clasificación funcional de los ESTs Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702 April 1, 2017 © Fernán Agüero

55 ESTs que mapean en intrones de genes conocidos
ESTs Tupaia ESTs que mapean en intrones de genes conocidos April 1, 2017 © Fernán Agüero

56 ESTs que mapean dentro de intrones de genes conocidos
ESTs Tupaia ESTs que mapean dentro de intrones de genes conocidos April 1, 2017 © Fernán Agüero

57 Tupaia ESTs April 1, 2017 © Fernán Agüero

58 Daniel Lawson, Sanger Centre
Acknowledgements Nicola Mulder, EBI Daniel Lawson, Sanger Centre April 1, 2017 © Fernán Agüero