Cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC

Presentación del tema: "Cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC"— Transcripción de la presentación:

1 Cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC

2 Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?
La cromatografía de líquidos de alta resolución, es un modo de cromatografía en la cual el proceso de separación y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase móvil y una temperatura dada.

3 La HPLC, representa una de las herramientas más empleadas en el laboratorio analítico moderno.
La cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases. Ya sea dedicado a la inv. Básica o aplicada, industrial o biológica. Según la Iupac: Una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. La primera puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un gel. La fase móvil puede ser liquida o gaseosa.

4 Diferencias. Fase Móvil
Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa. Si es un líquido: Cromatografía líquida. Cromatografía en capa delgada. Cromatografía líquida en columna abierta. HPLC.

5 Diferencias HPLC y GC: Tipo de detectores y la influencia de la fase móvil. GC: se utiliza para separar mezclas que contienen compuestos orgánicos volátiles. En GC es muy simple encontrar detectores que diferencien la muestra de la fase móvil. En HPLC es más difícil ya que la fase móvil no sólo no es inerte sino que su masa es sensiblemente superior. Los detectores más difundidos son el de UV y en menor proporción los de fluorescencia, índice de refracción y electroquímico. En HPLC, la fase móvil gobierna la separación, por esto, con una sola columna es posible separar sustancias polares, iónicas, ionizables y no polares, modificando la composición de la fase móvil.

6 Clasificación de la Cromatografía de Líquidos
Cromatografía Líquido-Sólido.(adsorción) Cromatografía Líquido-Líquido.(partición) Cromatografía de Fase (normal y reversa) Cromatografía de Intercambio iónico. Cromatografía de Exclusión por Tamaño (cromatografía en gel)

7 Fase Estacionaria Si la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil un líquido la Cromatografía se denomina CLS. Análogamente existirán una cromatografía CLL, CGL y CG. Así, la Cromatografía puede clasificarse en modalidades de afinidad y por tamaño molecular. LSC:C Líquido-sólido. LLC: Líquido-líquido. GLC: gas-líquido. GC: Gas-Sólido.

8 Clasificación por Afinidad
Cromatografía en fase normal. Cromatografía en fase ligada. Cromatografía de intercambio iónico. Con respecto a la afinidad, el analito interactúa directa o indirectamente, a través del solvente con la fase estacionaria, mientras que en las separaciones por tamaño molecular no existe ninguna interacción con la fase estacionaria

9 De Fase Ligada Reemplazando el tipo común de unión de la fase estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable por medio de una unión química covalente. Ahora las separaciones se efectúan sobre material químicamente modificado, con un amplio rango de polaridad y selectividad. Octadecilo, octilo, hexilo, butilo, etilo, ciano, diol, fenilo, amino, nitro, amonio cuaternario, resto sulfónico.

10 Intercambio iónico Se emplean rellenos en los cuales la partícula está constituida por un polímero o por sílica gel, en cada caso unida a un grupo funcional aniónico o catiónico. Típicamente sulfónico para el intercambio de cationes, amonio cuaternario para el intercambio de aniones.

11 Exclusión por Tamaño Emplea materiales de porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular. Si se dispone de estándares apropiados, de peso molecular adecuado, puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido. Las moléculas más grandes son las primeras en eluír, y las más pequeñas son las últimas. Proteínas para el análisis de proteínas.

12 Equipos

13 Clasificación de Equipos
Integrados: Cada una de sus partes están reunidas en un gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes es difícil. Modulares: Los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo según las necesidades, sino aumentar su complejidad según esa necesidad varíe. Reservorio de solventes, bomba, inyector y detector. Permiten en cambio un mejor aprovechamiento de espacio, menos cables, tuberías y conexiones expuestas y quizás menores riesgos frente a operadores oasionales o menos experimentados. Dicho de otro modo, la visualización de cada componente permite no solo el mejor conocimiento y control visual del equipo, sino el mejor aislamiento y resolución de problemas cuando estos se producen.

14 Componentes principales
Solvente Bomba de alta presión Inyector Columna Detector Graficador

15 Partes del cromatógrafo
En el caso más simple, el cromatógrafo líquido está constituido por: Un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la fase móvil. Un sistema para forzar el pasaje de la muestra por la columna: Bomba. Un sistema que permite la introducción de la muestra: Inyector. Un sistema de monitoreo de la solución que emerge de la columna: Detector. Un sistema de registro de los datos proveniente del detector.

16 Diagrama Básico de un sistema de HPLC

17 Esquema

18

19 Bases de la separación Cuando la fase móvil y la muestra son forzadas a atravesar la fase estacionaria, se presentan diferentes tipos de interacciones: hidrofóbicas, puentes de Hidrógeno, interacciones dipolares y electrostáticas, éstas son responsables de la mayor o menor afinidad de cada uno de los componentes de la muestra por alguna de las fases. Así, el componente más afín a la fase estacionaria se retiene más y tarda más en eluir y el más afín a la fase móvil se retiene menos y eluye antes.

20 Separación

21 Figura, 41 Explicar

22 La eficiencia de una columna cromatográfica y, por lo tanto, su poder separativo se mide en función de su número de platos teóricos. Para lograr la separación de dos componentes dados, no sólo deben eluir a distintos tiempos de retención, sino que el ancho de los picos debe ser tan bajo como sea posible.

23 Aspectos técnicos

24 Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?
HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de la mezcla. El solvente trabaja a una presión de 6,000 psig Los componentes o analitos deben ser disueltos en un solvente y se pasan por la columna cromatográfica a altas presiones. La resolución depende de la interacción entre el soluto , los componentes y la fase estacionaria.

25 Elección del Solvente Características: Disponible comercialmente
Precio Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impurezas. Disolver la muestra Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles

26 Eleccción del Solvente
Características: No degradar o disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV) Se prefieren solventes de punto de ebullición intermedio.

27 Tipos de solvente Name MW BP I.R. UV µ [°C] [nm] [cP] [Debye]
Viscosidad [°C] [nm] [cP] [Debye] Acetonitrile 41 82 1.341 195 .358 3.37 Dioxane 88 101 1.421 215 1.26 0.45 Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68 Methanol 32 65 1.326 .584 1.66 Isopropanol 60 1.375 2.39 Tetrahydrofuran 72 66 1.404 2.20 1.70 Water 18 100 1.333 185 1.00 1.84

28 Filtración y Desgasificación de solventes
Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre ( 0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

29 Filtración y Desgasificación de solventes
El Oxígeno Disuelto puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos. El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente

30 Métodos de Filtración de Solventes en HPLC
Hay tres(3) métodos comunes que se utilizan hoy para la filtración previa de los Solventes en HPLC : Filtro a la Entrada del Solvente Filtración al Vacío Filtración en Línea

31 Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC
Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso: Sonificación Burbujear Helio Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo Desgasificación al Vacío en Línea Temperatura

32 Preparación de fase móvil
Ajuste de pH, parámetro critico en la retención de solutos ionizables ( medir antes de dosificar modificador orgánico) El pH de la solución aumenta con la incorporación de un modificador orgánico. A valores pH mayores de 7.5 disolución de sílice ( sangrado) A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre la sílice y la fase enlazada.

33 Bombas Requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo: Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. Mantener el flujo libre de pulsaciones Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min).

34 Bombas Control y reproducibilidad del flujo de solvente
Componentes de la bomba resistentes a la corrosión

35 Bombas Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en: Mecánicas Recíprocantes De desplazamiento contínuo Neumáticas

36 Bombas Principio de la bomba reciprocante

37 Bomba w 600 Velocidad de flujo (0.01 a 0.5 ml/min, 0.1 y mayores con presión de 0 hasta 6000 psi Exactitud de flujo 0.5 % +/- 1.0 % Precisión +/- 0.1 % a 0.3 % Ruido : pulsaciones en intervalos de tiempo Deriva: cambios en intervalos de tiempo

38 Programación del Solvente
Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC: Isocrático Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras: A baja presión A alta presión

39

40 Sistemas de Inyección de muestra
Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión cuales ya están de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Válvulas inyectoras

41 Sistemas de Inyección de muestra
Generalmente se usa una válvula muestreadora con jeringa.

42 Válvula muestreadora

43 Columna Actualmente todas las columnas son de acero inoxidable 316 con diámetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6 a 5 mm , casi todas con un diámetro externo de ¼ de pulgada

44 Fase estacionaria Principales parámetros de la fase estacionaria
Tamaño de partícula: 3 a 10 µm Distribución de partícula : con una desviación máxima del 10 % Tamaño de poro : 70 a 300 Å; Área superficial : 50 a 250 m2/g Densidad de la fase (numero de sitios activos por unidad de área): 1 a 5 por 1 nm2

45 Distribución de partícula
La tabla que se muestra presenta los parámetros principales de algunos adsorbentes comerciales Nombre Vporo Dporo Área Sup. Distribución de partícula densidad de la fase ml/g Å m2/g % µM/m2 IB-Sil Phen. 0.75 125 165 5.5 2.74 Hypersil C4 (3) 0.6 300 50 2.0 4.80 Supelcosil C8 (3) 100 170 8.5 - Spherisorb C8 0.5 80 220 6.0 2.51 Novapak C18 0.3 60 120 7.0 3.0 IB-Sil C18 11.0 3.27 Spherisorb C18 12.0 2.72 Prodigy C18 1.17 150 310 18.7 3.30 Inertsil C18 1.1 320 18.5 3.23 Hypersil C8 0.7 3.85 Hypersil C18 (3) 10.0 2.84 Selectosil C18 0.9 110 2.93

46 Columna Fuentes de daño de una columna de HPLC:
Obstrucción por partículas pequeñas en los solventes o fases móviles Obstrucción por materiales no eluídos en las muestras Variación de las características de retención por incremento de materiales no eluídos

47 Detectores

48 Detección La eficiencia de un detector cromatográfico depende de la relación entre la cantidad física medida y la composición del efluente, así como también de las características de las señal de transferida. Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: Detectores basados en una propiedad de la fase móvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refracción Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta

49 Detección Detector UV. Hay básicamente tres tipos:
Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos

50 Detección Detector UV. Hay básicamente tres tipos:
Detector de Longitud de Onda Fija El espectro se divide en : infrarrojo (IR) 2, ,000 Infrarrojo cercano ,500 Visible Ultravioleta (UV) nm

51 Detección Detector de Índice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: Tipo Deflexión Tipo Fresnel

52 Detección Detector de Fluorescencia.
Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización . Detector de Fluorescencia Inducida por Laser Según la Fuente de Excitación Según el sistema óptico

53 Catálogo Revisar catalogo Preparación de la muestra
Características de columnas Aplicaciones especificas

54 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas posibles, y cómo solucionarlos. Presión Alta Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas. Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presión sigue alta reemplace la columna. Solución a largo plazo: Asegurase que todas las fases móviles se filtren apropiadamente antes que entren a la bomba de HPLC . También filtre todas las muestras antes de inyectarlas.

55 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Pérdida de la Resolución Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas. Solución: vea la sección de Presión Alta Solución a largo plazo: Filtrar todo antes de que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.

56 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Picos Hendidos Posible causa : Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas. Solución: La columna se desatornilla. Si es necesario reemplazar la columna. Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.

57 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Variación en los Tiempos de Retención Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil. Solución: Degasificación de la Bomba Solución a larga plazo: Asegurase fase móvil este propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificación electrónica en la línea asegurarse de que la cadencia del flujo no es demasiado alto.

58 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Variaciones de la Línea Base Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala desgasificación de los solventes de la fase móvil. Solución: Asegurese que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de corriente del detector.

59 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Línea Base con mucho Ruido Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba. Solución: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase móvil del sistema.

60 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia) Posible causa: Oxígeno Disuelto Solución: Desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de oxígeno disuelto. Solución a largo plazo: Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente chequear el nivel de oxígeno disuelto.

61 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Baja ó Ninguna Presión Posible causa: Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a partículas en suspensión en la fase móvil. Solución: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.