Pasantía en Rosario Diciembre 2007-Febrero 2008

Presentación del tema: "Pasantía en Rosario Diciembre 2007-Febrero 2008"— Transcripción de la presentación:

1 Pasantía en Rosario Diciembre 2007-Febrero 2008

2 Presentación del Modelo
Trypanosoma cruzi y sus particularidades

3 Enferemdad de Chagas Varios millones de personas afectadas
Agente causante: T. cruzi

4 Estabilidad del Mensaje - Movilización
Expresión génica gen A gen B gen C gen D gen E gen D ADN Transcription ARN policistronico Trans-splicing Poli adenilación ARNm individual AAAAA Estabilidad del Mensaje - Movilización AAAAA … Traducción AAAAA Modificaciones

5 Importancia de la regulación post-transcripcional
Estabilidad Traducción Cambios rápidos en la expresión génica Proteínas de unión al ARN (UTR’s) Familia Pumilio Drosophila Estabilidad y traducción Dominio conservado de interacción Estudios en levadura 10 miembros en T. cruzi TcPuf6

6 Antecedentes de la pasantía

7 TcPuf6 No esencial para el crecimiento
Sobreexpresión en T. brucei reduce infectividad Expresión constitutiva

8 Mensajeros asociados a TcPuf6

9 Interacción entre TcPUF-6 y TcDdh1

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11 Objetivos

12 Demostrar la unión de la proteína homologa a Pop2 en T
Demostrar la unión de la proteína homologa a Pop2 en T. cruzi a TcPuf6 por medio de ensayos de Y2H Clonar (y expresar) dicha proteína para continuar con su caracterización

13 Procedimiento experimental

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15 Doble híbrido en levadura

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19 Resultados

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21 Doble híbrido en levadura
pEntr-pop2 pEntr-puf6 Clonasa pGad-pop2 pGbk-pop2 pGad-puf6 pGbk-puf6

22 Cotransfecciones relevantes
Para ver interacción: pGad-pop2/pGbk-puf6 pGad-puf6/pGbk-pop2 Controles de auto-activación por pop2: pGbk-pop2/pGad-T7 pGad-pop2/pGbk-T7 Controles de auto-activación por puf6: pGbk-puf62/pGad-T7 pGad-puf6/pGbk-T7 Control negativo pGad-T7/pGbk-T7 Cotransfección de ambas fusiones Cotransfección con un vector vacío Cotransfección con ambos vectores vacios

23 Master Plates (-LT)

24 Controles autoactivación pGBK
-LT ura his 50mM 3AT

25 Placas –LT –H 3AT pGBK-Puf/pGAD-pop

26 Placas –LT –Ura pGBK-Puf/pGAD-pop

27 Método de las diluciones
-LT –LT –Ura –LT –His 50mM3AT Cont Gad Cont - Cont Gbk Gbk-pop/ Gad-puf

28 Producción de proteína recombinante en E. coli
pEntr-pop2 Clonasa pDest-pop2 pGex-pop2

29 Inducción con 1mM IPTG S/ind His Gst MW Pop-gst??

30 Concluisones Se logro clonar TcPop2
Existe una interacción entre TcPuf6 y TcPop2 en este sistema Podríamos tener un sistema de sobreexpresión de TcPop2-Gst para continuar con la caracterización del sistema

31 Cosas pendientes Controles… Purificar TcPop2
Validar en un segundo sistema la interacción encontrada (Anticuerpo)

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