Cultivo de Virus y técnicas para estudiarlos.

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1 Cultivo de Virus y técnicas para estudiarlos.
En las primeras décadas de los 1900, los virus se cultivaban en animales. El ratón y los monos eran hospederos comunes.

2 Crecimiento y propagación en huevos
Huevos embrionados inoculados con virus

3 Sucesos importantes 1949 Enders, Weller & Robins : Premio Nobel Cultivaron virus en monocapas de células de tejido embrionario. 1951 Hopkins,J. : Cultiva línea celular inmortalizada de Henrietta Lacks que sufría de cáncer cervical. Creación de células HeLa.

4 Creación de línea celular

5 Cultivo en el lab En platos petri ó frascos:

6 Virus en células en medio enriquecido

7 Cultivo en diferentes líneas celulares
Célula 1ria continua: tejido se segrega Ej. Fibroblastos

8 Líneas celulares Línea celular diploide W1-38 de pulmón
Línea de epitelio humano ( HeLa) Línea 1ria de prepucio humano Línea de fibroblastos de ratón

9 ¿Cómo sabemos si los virus se están propagando en las células?
!Una forma sería estudiando el efecto citopático! (CPE) Esto se refiere a los cambios que el virus provoca en las células. Puede ser en el núcleo ó en el citoplasma.

10 Señales de efecto citopático
Células redondeadas Más espacios entre ellas Grumos y comenzar a sufrir lisis Formación de un *Sincicio * célula grande con muchos núcleos por la fusión de células

11 Ejemplos de efecto citopático
En Herpes: proliferación en membrana celular , vacuolas en el citoplasma y rompimiento de cromosomas en la célula que infecta, redondeo de células En Polio: Vacuolas en el citoplasma En Picornavirus, Rhabdovirus, Adenovirus y Herpes: Redondeo y desprendimiento de las células

12 Análisis de Virus 1930 Ensayo de placas: Permite estudiar la multiplicación de bacteriófagos 1975 Dulbecco,R. Premio Nobel: los virus /animales forman placas de una manera similar.

13 Análisis cuantitativos
Preguntas guías: ¿cuántos Virus? ¿cómo se miden?

14 Determinación del PFU PFU= unidades formadoras de placas
# de placas X factor de dilución Ej. 17 placas X 10^6 PFU= 1.7 x 10^8

15 Cinetica de “Hits” Cinética de 1 hit= 1 partícula viral es suficiente para formar 1 placa. # de placas es proporcional directamente a la concentración del virus. Cinética de 2 hits= se necesitan 2 partículas para hacer una placa.

16 Ensayo de dilución punto final
NO siempre los virus forman placas… entonces… Se puede medir el TCID 50 : mide muerte de las células en placas de 96 pozos. Se hacen 10 monocapas de cultivos celulares y se infectan con diluciones del virus para identificar el efecto citopático en la mitad de los cultivos. En las diluciones bajas, todos los cultivos son infectados.

17 Efecto citopáticoTCID50

18 Estudio del enlace

19 Proporción partícula-PFU
#de partículas virales muestra/ # de partículas infecciosas

20 Ensayos para medir partículas infecciosas
Hemaaglutinación: Se mezclan eritrocitos con ciertos virus como el de la Influenza y se unen causando aglutinación. Aglutinan RBC humanos: Influenza Rotavirus Aglutinan RBC de Gansos: RabiesVirus

21 Virus que aglutinan RBC
Influenza: humano Parainfluenza: humano Flavivirus: ganso, paloma Parvovirus: cobayo, humano, cerdo Poxvirus: Pollo

22 Inhibición de la Hemaglutinación (HAI)‏
Algunos virus poseen la capacidad de unirse a la membrana de RBC ocasionando agregados. El virus de la influenza en particular es muy propenso a esta reación. De hecho es por eso que su antígeno más importante, la Hemaglutinina (HA) se llama así.

23 Hemaglutinación e inhibición

24 Inhibición de la Hemaglutinación (HAI)‏
Al dejarse reaccionar, las muestras de suero que posean anticuerpos contra el virus de la influenza INHIBIRAN la aglutinación. Los RBC se precipitarán al fondo del pocillo.

25 Inhibición de la Hemaglutinación (HAI)‏
De no existir anticuerpos específicos para el virus de la influenza, los antígenos que agregamos (la HA, en particular) ocasionará la AGLUTINACIÓN de los RBC. Los RBC aglutinados no precipitan.

26 Inmunotinción: se usan fluorocromos y microscopía de fluorescencia
Directa: Ag viral-Abs específicos-fluorocromo Indirecta: Es más específica porque usa un 2do anticuerpo. Ag viral-Abs 1rios-Abs2rios-fluorocromo

27 Inmunofluorescencia

28 ELISA Enzyme linked-immuno sorbent assay

29 Estudio de enlace

30 ELISA: detecta Agviral ó anticuerpos

31 ELISA: detecta hasta el rango picomolar 10^-12
Para detectar proteínas virales en el suero ó en la muestra clínica , se usan Abs contra la Proteína viral . Se acoplan a placas de 96 pozos Se añade la muestra clínica y si laproteína viral está presente, al añadir Abs ésta se une y al añadir un Ab 2rio que a su vez esta conjugado a una enzima como la peroxidasa de rábano y a un sustrato. Ocurre una reacción.

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33 Enlaces técnica ELISA Muy usado para los siguientes virus: HIV, HTLV. Adenovirus, citomegalovirus, Papiloma

34 SDS-PAGE Separa las proteínas en geles de poliacrilamida. El sodium dodecyl sulfate (SDS) es un detergente aniónicoque alinea las proteínas y le imparte una carga negativa.

35 Importantes enlaces https://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U

36 Western blot Si un virus infecta células, es posible separar las proteínas virales acopladas a anticuerpos específicos para esas proteínas en una gel de poliacrilamida con electroforesis. La gel es transferida a una membrana con afinidad a las proteínas separadas. La gel y la membrana son colocadas entre papel absorbente para transferir las proteínas a la membrana por acción capilar.

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38 Se puede incubar la membrana con anticuerpos específicos para la proteína viral conjugados a una enzima como la peroxidasa de rábano. Luego se incuba con un sustrato. Las proteínas pueden luego visualizarse con “x-rays film”

39 Estudio de la técnica http://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs
Actividad en el salón de clases: Estudie el video Familarízate con el equipo Identifique los componentes y reactivos principales usados Reconocer su Utilidad en la id. de proteínas Virales

40 Variante de la técnica Podría usarse un anticuerpo primario para que se una a la proteína en la membrana y luego añadir un anticuerpo 2rio dirigido al 1er anticuerpo. Pase a ver diagrama disponible en el blog del Dr. V. Racaniello

41 Southern blot: separa DNA

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44 Southern blot.. Separa DNA basado en tamaño
Se transfieren fragmemtos de DNA a gel de agarosa Fragmentos pequeños se mueven más rápido

45 PCR Técnica de Polimerasa en cadena
Permite amplificar DNA y hacer millones de copias de la molécula Ciclos: Se eleva la temperatura a 95 grados para separar cadenas o desnaturalizarlas Se baja la temperatura a 60 grados para permitir la unión de los “primers” de DNA. Lo s “primers”sirven de molde para que la Taq DNA polimerasa añada nuevas secuencias al terminal 3’.. Esto a 72 grados.

46 Productos del Final del ciclo 1
2 cadenas de DNA doble hélice

47 Ciclo 2 de la PCR Se repiten los pasos del ciclo 1
Desnaturalización a 95 grados Unión de los primers a 65 grados Síntesis de la polimerasas a 72 grados

48 Productos al final del ciclo 2
4 cadenas de DNA

49 Ciclo 3 Se vuelven a repetir los ciclos anteriores
6 cadenas de DNA dovle cadena con terminal 3’ siempre más largo y 2 cadenas “molde”.

50 Ciclo 4 Repetición de pasos Continúa el proceso de amplificación
8 moléculas de DNA y 8 primers

51 Ciclos adicionales… Al final de 30 ciclos habrán millones de copias del DNA “target”

52 Técnicas noveles Pirosecuenciación
se basa en controlar el flujo secuencial y cíclico de nucleótidos sobre una placa en combinación con un sistema de detección bioluminiscente que permite convertir los productos generados durante la incorporación de nucleótidos (pirofosfato) en luz (por medio de la luciferasa) que es detectable por el dispositivo CCD.