Western blotting, inmunoblotting o SDS-PAGE

Presentación del tema: "Western blotting, inmunoblotting o SDS-PAGE"— Transcripción de la presentación:

1 Western blotting, inmunoblotting o SDS-PAGE
Tecnica para detectar proteinas especificas separadas por electroforesis utilizando anticuerpos marcados.

2 Secuencia del Western blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la membrana de nitrocelulosa Incubacion con el anticuerpo especifico primario Lavados del anticuerpo no unido Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP) Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas radiograficas

3 Secuencia del Western blot – Paso 1
Electroforesis de las muestras de proteínas: -Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S- -El SDS aporta cargas negativas -Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gel de acuerdo a su peso molecular Proteínas ya corriendo en el gel Fuente de poder Muestra de proteínas para cargar en el gel

4 Secuencia del Western blot – Paso 2
Paso 2 - Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: -Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa -Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas Se detiene la corrida electroforetica Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar el gel con las proteinas separadas por masa El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia Se quitan las burbujas para asegurar la correcta transferencia Armado del cassette de transferencia Cassette listo para iniciar transferencia

5 Incubación con anticuerpos específicos y revelado:
Paso 3 Incubación con anticuerpos específicos y revelado: Paso 4 Revelado y análisis: Proteína sobre la membrana Bloqueo de los sitios no ocupados en la membrana con proteína inerte (ej. Albúmina) Incubar con anticuerpo primario Incubar con anticuerpo secundario marcado con HRP Incubar con sustrato especifico Revelado quimioluminiscente Proteína de interes se ve como una banda oscura

6 Fundamento de la tecnica de revelado quimioluminiscente
-El anticuerpo secundario esta marcado con HRP (peroxidasa) que en presencia de agua oxigenada degrada el luminol con emisión de luz -La emisión de luz (fotones) se revela en oscuridad sobre una placa radiográfica sensible a la luz -Las bandas se obtienen en el film en la misma posición donde se encontraba la proteína -Alta sensibilidad

7 Existen otras tecnicas de revelado de WB
sustrato enzima H2O2 producto coloreado quimioLum Obs luminol HRP si no muy sensible 3,3´diaminobencidina marrón toxico DAB+niquel negro toxico, mas sensible que DAB 3,3´,5, 5´ tetrametilbencidina azul producto semisoluble 4 cloro naftol azul-negro poco sensible Bromocloroindolil fostato +NBT FAL reaccion lenta y progresiva Naftol-AS-MX fosfato + Fast red rojo AP/misty purple purpura muy estable HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina

8 Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIV
env gp160 gp120 gp 41 gag p55 p18 p24 pol p65 p51 p31 -Se corren proteínas de HIV -Se transfieren a nitrocelulosa -Se incuba la membrana con suero del paciente -Se revela con anticuerpos secundarios Commercial Methods in Clinical Microbiology ASM Press.

9 Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIV
Criterio de la OMS: -Negativo: Ninguna banda presente -Positivo: Dos bandas ENV presentes -Indeterminado: Cualquier banda que no alcance criterio de positividad env gp160 gp120 gp 41 gag p55 p18 p24 pol p65 p51 p31

10 Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIV Seroconversion de un paciente
gp160/120 p66 p55/51 gp41 p32 p24 p17