METODOS DE SIEMBRA. INTRODUCCION Para poder estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones.

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1 METODOS DE SIEMBRA

2 INTRODUCCION Para poder estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone previamente de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:

3 *Que no exista la cantidad suficiente del microorganismo que se busca. *Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, parte ( los cuales son contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros. Generalmente los procesos infecciosos están creados por un agente causal sin embargo, es fácil que puedan proliferar en esas condiciones otros microorganismos oportunistas o incluso contaminantes. De ahí que una forma de evitar estos errores sea aislarlos inicialmente y posteriormente identificarlos

4 MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION Existen los siguientes materiales: Asas de siembraHilos de platino Asas de DigraskyHisopos Pipetas

5 MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 1. ASAS DE SIEMBRA El asa de siembra es utilizada para la inoculación o siembra por estría en medios sólidos, por picadura en medios sólidos semisólidos y para la siembra de medios líquidos. Estas asas se llaman también de platino porque con este material se fabricaron por primera vez, aunque en la actualidad no se suelen utilizar. Éstas han sido sustituidas por asas de acero inoxidable o cromo- níquel. Presentan un arco bastante cerrado en su extremo, cuyo diámetro es más o menos específico es decir, muchas de las asas son calibradas correspondiendo a un volúmen determinado de siembra. Las más utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.

6 MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 2. HILOS DE PLATINO Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semisólidos o sólidos.

7 MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 3. ASAS DE DIGRASKY Son asas de vidrio con forma de triángulo más menos abierto. Se utilizan para extender el inoculo líquido previamente adicionado en la placa, por ejemplo, a través de pipeta Pasteur. Se esterilizan en estufa, en autoclave, aunque generalmente se puede hacer metiéndola en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.

8 MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 4. HISOPOS Se utilizan para la toma de muestras e incluso en muchos casos llevan un medio de transporte incorporado que permite transportar muestra sin que ésta sufra ninguna desecación, deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio cultivo. Se suele comercializar ya estéril, listo para utilizar y desechables.

9 MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 5. PIPETAS Pueden ser de vidrio, reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente desechables. *Pueden ser graduadas (contienen volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para pipetas tipo pera o prepipeta. *Pipetas Pasteur (no contienen volúmenes graduados), muy utilizadas en bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma que no tienen porqué ser necesariamente estériles, aunque sí la pipeta. *Micropipetas utilizadas para la siembra de mililitros y microlitros en un determinado medio de cultivo.

10 PREPARACIÓN DE INÓCULOS Un inoculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismo problema. Se debe partir de un cultivo puro y De una concentración adecuada de microorganismo problema. Si la muestra no es pura se aplicarán distintos métodos para el aislamiento mediante técnicas específicas: Siembra por estría en placa o por agotamiento, Emplear la técnica de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento más o menos separado de los microorganismos. Utilizar medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que permiten el crecimiento del tipo de microorganismo concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como cultivo puro.

11 PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si el problema está en la cantidad de microorganismo, que no es suficiente, será necesario preparar un inoculo con el fin de obtener una cantidad microbiana suficiente y representativa para obtener resultados fiables.

12 MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta Pasteur estéril en cantidad suficiente y, en ambos casos, se homogeneizará posteriormente en el medio específico de cultivo. Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se homogeneizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para microorganismos patógenos coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesario la utilización de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación posterior y de la cantidad de inoculo que se requiera.

13 MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido se utilizarán diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verificará el cultivo; por ejemplo, siembra por agotamiento.

14 MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y se adiciona a un medio de cultivo líquido, se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer a una temperatura adecuada (unos 37 °C) en un tiempo aproximado de 24 horas. Es importante que los inoculos sean siempre jóvenes y en ocasiones excepcionales, sobre todo, si se necesita de mucha cantidad de inoculo, se podría utilizar rotavapor.

15 MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y ésta se añade al medio sólido, posteriormente se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa incubándose a la temperatura adecuada durante aproximadamente unas 24 horas. Se requerirán también cultivos jóvenes. Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o, incluso, caldo de cultivo base.

16 MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS A veces es necesario partir de un inoculo con un número aproximado de microorganismos problema. En estos casos, los inoculos se establecen en medios líquidos y el número de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparación de medios líquidos con diferentes gradientes de turbidez. Éste es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una batería de tubos cada uno de los cuales tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos

17 MÉTODOS DE INOCULACIÓN O SIEMBRA (MÉTODOS DE AISLAMIENTO) El paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea líquido o sólido, se denomina siembra o inoculación. El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. Toda siembra, inoculación, o incluso resiembra, se puede realizar de diferentes formas según las características de la muestra, del medio en el que se van a sembrar o resembrar, del tipo de material que se utilice, etc. A continuación, se explican los métodos más importantes de siembra o inoculación.

18 SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO LÍQUIDO Si se realiza con asa de siembra, ésta se carga con la muestra problema sólida o a veces líquida en condiciones de esterilidad y se adiciona al medio líquido agitándola. Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y se vierte al medio de cultivo líquido agitándose hasta su homogeneízación. Si se realiza con escobillón o hisopo el método es igual que con el asa de siembra.

19 SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO SOLIDO Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. 1. Siembra del inoculo en placa Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. A.Técnica de Barry B. Asa de Digrasky C. Agotamiento por estría D. Técnica de los cuatro cuadrantes E. Técnica de los tres giros

20 Técnica de Barry Siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a una temperatura de 45 a 50 °C) en tubo, se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogeniza la muestra en el tubo mediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará solidificar. La mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación del CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos.

21 Asa de Digrasky Siembra de muestra líquida en placa con asa de Digrasky Consiste en adicionar al medio sólido un inoculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 mililitro según los casos con pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se suele utilizar para el recuento de viables, antibiogramas, etc.

22 Siembra por agotamiento o aislamiento en estría Se tomará con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir de aquí se realizarán movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en ningún momento nuevo inoculo y no levantándose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa.

23 Siembra por agotamiento Aislamiento en estría múltiple. Se tomará muestra problema con asa de siembra previamente estéril y dicho inoculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de ésta, sólo en la parte superior. Flameamos el asa de platino y giramos ligeramente dicha placa repitiendo el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asa de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma dirección se repite la operación hasta un total de 4 o 5 veces, que son las que tienen cavida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior de la misma.

24 Siembra por agotamiento Aislamiento en estría múltiple. El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez se va arrastrando y separando más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en cada estría un flameado previo del asa de siembra.

25 Técnica de los cuatro cuadrantes Con un rotulador, por ejemplo, para vidrio, en la base de la placa (reverso) se dibujan dos líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa de tal forma que ésta quede dividida en 4 cuadrantes iguales. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de inoculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag. Realizaremos la misma operación sin flamear en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema, observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o separadas.

26 Técnica de siembra por dilución Se dispondrá de una batería de tubo» con medio de cultivo específico o agua estéril según los casos. Se adicionará una cantidad de muestra sólida o líquida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inoculo que se añade en el tubo inicial. Se agitará hasta homogeneización. Con pipeta estéril se tomará una cantidad específica o exacta y se adicionará al segundo tubo, que se homogeneiza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada.

27 Técnica de siembra por dilución Con la dilución esperada, por ejemplo! 103 y 104, inocular en placas de cultivo una cantidad de inoculo exacto y extender con asa de Digrasky previamente estéril. Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.

28 Siembra del inoculo en tubo 1. Siembra por estría en tubos con medio sólido inclinado. Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zig- zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos periodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas, como, por ejemplo, la prueba de la ureasa.

29 Siembra del inoculo en tubo 2.Siembra por picadura. Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de éste y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos como por ejemplo, el medio de oxidación fermentación de Hugh-Leiffson.

30 .Siembra por picadura Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de éste y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos como por ejemplo, el medio de oxidación fermentación de Hugh-Leiffson.

31 Siembra del inoculo en tubo Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría; son ejemplos de este tipo de siembra la prueba en medio KIA y la prueba en medio citrato, entre otras. 3. Siembra por picadura y estría.

32 CULTIVO DE CEPAS Aunque todo lo referente a cultivos se ha estudiado en el tema correspondiente a cultivos, señalaremos aquí que tras la preparación de un inóculo y posterior inoculación en el adecuado medio de cultivo se requerirán una serie de condiciones para que la siembra pueda desarrollarse y realizar posteriormente los oportunos estudios cualitativos y cuantitativos del microorganismo problema. Así pues, de acuerdo con lo dicho, todo cultivo de cepas para poder crecer como tal, requerirá de una serie de condiciones adecuadas, que serán las siguientes:

33 METODO DE SIEMBRA EN PLACA POR ESTRIA CULTIVOS PUROS Se esteriliza el asa y luego se extrae con ella un inóculo del tubo. Se hace estrias en la placa extendiendo los microorganismos. El asa se vuelve a esterilizar entre distintas operaciones.