Implementación de un sistema experimental para el estudio funcional de microRNAs asociados a la infección de bacterias no cultivables del género Candidatus.

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1 Implementación de un sistema experimental para el estudio funcional de microRNAs asociados a la infección de bacterias no cultivables del género Candidatus Liberibacter María Cristina Hernández-Peraza, Edgar Antonio Rodríguez-Negrete, María Elena Santos-Cervantes, Jesús Méndez- Lozano, Norma Elena Leyva-López. Instituto Politécnico Nacional, Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR-IPN, Unidad Sinaloa) Guasave, Sinaloa. CP: Introducción. El creciente impacto de las bacterias no cultivables limitadas al floema en los cultivos de importancia agronómica ha llevado a un renovado interés en comprender la etiología de la enfermedad . El género "Candidatus Liberibacter" está asociado con enfermedades económicamente devastadoras en muchos cultivos en todo el mundo (1). Candidatus Liberibacter asiaticus afectando a los cítricos siendo agente causal del HLB (Huanglongbing), mientras que Candidatus Liberibacter solanaceraum (Lso) se asocia a la Zebra Chip (ZC) en papas y otros cultivos de hortalizas (2). Los patógenos limitados al floema tienen genomas pequeños y carecen de muchos genes necesarios para los procesos metabólicos centrales, que es, en parte, una adaptación al entorno único del floema (3). Recientemente, varios miRNAs se han implicado en la respuesta al estrés de las plantas desempeñando un papel vital en la regulación de las respuestas del huésped a la infección por patógenos. Comprender los mecanismos de defensa de las plantas contra bacterias no cultivables es crucial para proponer nuevos estrategias de control. El objetivo de este trabajo es establecer un sistema experimental para estudiar el proceso infeccioso de bacterias no cultivables del género Candidatus Liberibacter. Metodología Se utilizaron tubérculos de papa (Var. Citlali, INIFAP 5-10) afectados por la enfermedad Zebra Chip (ZC) como fuente de inóculo. La enfermedad ZC se detectó en plantas emergentes por la aparición de síntomas foliares y la detección molecular por PCR con los primers OI2c / OA2. Los productos de PCR se purificaron, clonaron y secuenciaron. Las secuencias obtenidas de Lso se compararon con otras especies utilizando el Genbank (NCBI) de BLASTn. Se usaron plantas de papa Lso-PCR positivas como fuente de inóculo para trasmitir la bacteria (mediante injertos) a plantas de tomate. Por PCR cuantitativa (qPCR) usando los primers (CLsoF / CLsR) se determinó el titulo de la bacteria en las plantas inoculadas durante períodos de tiempo (14, 28, 42, 56, 70 dpi). Resultados El análisis de las secuencia del fragmento amplificado por PCR papa (Var. Citlali) reveló una similitud de 99% con el haplotipo B de Lso asociado a ZC. 27 de las 36 plantas de tomate injertadas mostraron síntomas asociados a la enfermedad a 42 dpi (Fig. 1). Lso fue detectado por PCR solo en las plantas sintomáticas a los 42 dpi, mostrando una eficiencia de transmisión del 75%. El título bacteriano varió de 1,00E + 03 a 1,00E + 05 células de Lso / 100 ng de DNA a lo largo de los períodos analizados (14, 28, 42, 56, 70 dpi) (Fig. 2). Fig 1. Sintomatología asociada a Lso en plantas de tomate (Permanente del tomate) durante 70 dpi. Fig 2. Cinética de infección de Lso en plantas de tomate durante 70 dpi. Discusiones y Conclusiones El establecimiento del patosistema Lso-tomate fue exitoso y eficiente, los títulos de Lso en las diferentes plantas se comportaron de manera homogénea, los síntomas severos aparecen alrededor de 42 dpi. Este modelo es una herramienta alterna para estudiar la regulación genética de los mecanismos de defensa de la planta contra la infección por bacterias limitadas al floema. El estudio de la cinética de infección basado en la cuantificación del título bacteriano permitió identificar los puntos cruciales a lo largo del proceso infectivo de Lso permitiendo estudiar los diferentes mecanismos de defensa en la planta y virulencia del patógeno en etapas tempranas y tardías. Los estudios funcionales de los miRNAs involucrados en la respuesta contra bacterias no cultivables son muy limitados. Este nuevo sistema, junto con la tecnología Mir-VIGS, se usaría para determinar el rol biológico de los miRNAs involucrados en la respuesta contra la infección de estos patógenos. Acknowledgements. We thank Instituto Politécnico Nacional (BEIFI) and CONACYT for the financial support. References. 1. Wang N, Pierson E, Setubal J, Xu J, Levy J, Zhang Y, Li J, Rangel L, Martins J. (2017). Annu Rev Phytopathol. 55:451–82 2. Haapalainen N. (2014). Ann Appl Biol. 165:172–198 3. Bendix C, Lewis J. (2017). Mol Plant Pathol. 19:38-254