Генетичен код Транслация Въведение в молекулярната биология Лекция 3.

Presentación del tema: "Генетичен код Транслация Въведение в молекулярната биология Лекция 3."— Transcripción de la presentación:

1 Генетичен код Транслация Въведение в молекулярната биология Лекция 3

2 Транслация Генетичен код Транспортни РНК Информационни РНК Рибозоми

3 Експресия на гените или „централната догма“ днес Биологичната информация в ДНК се намира в секвенцията на нуклеотидите във веригата. Генната експресия е процес, при който информацията става достъпна за клетката. Използването на информацията се описва от т. нар. централна догма в молекулярната биология.

4 Генетичният код – връзката между НК и белтъците? секвенцията на базите секвенцията на аминокиселините Каква е връзката между секвенцията на базите в ДНК или РНК и секвенцията на аминокиселините (АК) в белтъците? Този въпрос – за „генетичният код“ - е в основата на сътрудничеството между Francis Crick, Sydney Brenner, Leslie Barnett и Watts-Tobin което започва в края на 50-те години. Всъщност, това е основната експериментална работа, с която Крик се занимава преди (и по време) на създаване на модела на двойната спирала на ДНК. бактериофага T4, В една дълга серия от дълги и сложни експерименти те предизвикват мутации в ДНК на бактериофага T4, вирус, който инфектира бактериите. Мутациите променят единични бази в ДНК, блокирайки функцията на един критичен фагов ген (цистрона В на областта rII на T4; мутациите са предизвиквани от профлавин, който предизвиква делеции или инсерции на бази).

5 Преди да се разгледа механизмът на транслацията, уместно е да се обсъди крайният и резултат. Информацията за даден белтък по същество се запазва по пътя от ДНК до белтъка, само се преобразува от нуклеотиден в аминокиселинен запис. Всеки начин да се прехвърля информация от една в друга система от знаци се нарича код. Закономерностите, които съпоставят аминокиселини на нуклеотидите от мРНК, представляват т. нар. генетичен код. Терминът транслация е създаден по аналогия с превеждането от един език на друг; ако продължим сравнението, то генетичният код е нуклеиново-белтъчният речник. Генетичен код

6 Информацията за даден белтък по същество се запазва по пътя от ДНК до белтъка, само се преобразува от нуклеотиден в аминокиселинен запис. Всеки начин да се прехвърля информация от една в друга система от знаци се нарича код. Закономерностите, които съпоставят аминокиселините на нуклеотидите от мРНК, представляват т. нар. генетичен код. Терминът транслация е създаден по аналогия с превеждането от един език на друг; ако продължим сравнението, то генетичният код е нуклеиново-белтъчният речник. Най-простият тип код е синглетният, който на един знак съпоставя също един знак. Генетичният код обаче не би могъл да бъде синглетен. В мРНК има 4 вида нуклеотиди. При синглетен код те биха съответствали на 4 аминокиселини, а в белтъчната синтеза участват 20 различни аминокиселини. Следващата възможност е дублетен код: на 2 нуклеотида да се съпоставя 1 аминокиселина. Съчетанията от 2 нуклеотида са 4 на квадрат = 16 – не достигат за малко. При триплетен код 3 нуклеотида биха кодирали 1 аминокиселина. Възможните съчетания от 3 нуклеотида, наречени триплети, са 4 на куб. = 64. Това е повече от достатъчно за кодиране на 20 аминокиселини.

7 Така още преди да е направен първият опит за установяване на генетичния код, е станало ясно, че кодът трябва да е триплетен. Триплетите в мРНК са били наречени кодони. На този етап са възникнали други въпроси: дали от възможните 64 кодона се използват само 20 или кодът е изроден, т.е. някои аминокиселини се кодират от 2 или повече триплета; дали има нуклеотиди, които участват едновременно в 2 съседни кодона (кодът се припокрива); или обратно, има разделителни знаци (нуклеотиди, които разделят съседни кодони, без да участват в нито един от тях); има ли специални кодони или други съчетания за начало и край; и, разбира се, кой кодон на коя аминокиселина отговаря и дали в това отношение има разлики при различните организми. Натрупването на познания за РНК, белтъците и белтък синтезиращия апарат е позволило да се отговори на тези въпроси. Първо изкуствено (без участието на ДНК-матрица) са били синтезирани къси вериги РНК с известна последователност. Те са били прибавяни вместо мРНК в система за транслация in vitro. Полученият полипептид е бил подлаган на секвениране (определяне на първичната структура) и сравняван с изкуствената РНК. Генетичен код

8 Кодоните, които определят една и съща АК се наричат синонимни и са сравнително сходни. Например всички кодони ACU, ACC, ACA и ACG определят АК треонин. Разликите в кодоните са само в базата на трета позиция, която се означава люлееща позиция (wobbling). Изродеността на кода намалява ефекта от мутациите, така че промените в секвенцията на ДНК имат по-малък шанс да променят секвенцията на АК в белтъка и да променят неговата функция. Генетичен код ACU/CACC ACA/C ACG/C АК треонин

9 „Cracking the Code” или какво установява Крик? Когато има две или четири мутации, генът е неактивен, но когато в него са вкарвани три мутации едновременно – генът е все още активен. Те заключават, че генетичния код е триплетен (три бази, кодират една аминокиселина) и че кода е дегенеративен (една аминокиселина може да бъде кодирана от повече от един триплет). През 1960s, групата на Marshall Nirenberg „разбива“ кода, като установява кой триплет от нуклеотиди, коя аминокиселина кодира. Крик пише: „Макар че и двамата със Сидни (Бренер) осъзнавахме, че генетичния код е биохимичен проблем, ние все още се надявахме, че генетичните методи могат да допринесат за разрешаването му, тъй като при използването на подходящ материал те могат да бъдат много бързи…

10 През 1961 Ниренберг и Матей инкубират синтетичен полиуридилат (поли (U)) с екстракт от Е. coli, ГТФ, АТФ и смес от двадесетте аминокиселини в 20 различни епруветки, като във всяка епруветка има различна радиоактивно белязана аминокиселина. Очаква се поли (U) иРНК да доведе до синтезата на полипептид (ПП) само от аминокиселината, която се кодира от триплет UUU. Установено е, че кодираната аминокиселина е фенилаланин и радиоактивен ПП се формира само в една от 20-те епруветки. Същият експеримент доказва, че поли (С) кодира полипептид от пролин, поли (А) кодира полилизин. „Cracking the Code” Фенилаланин UUUUUUUUUUUU Е. coli 1 Aмино киселина

11 Синтетичните полинуклетиди, които се използват в този експеримент се приготвят с полинуклеотид фосфорилаза, катализираща формирането на РНК полимери от ADP, UDP, GDP и CDP. Този ензим не се нуждае от матрица и създава полимери с базов състав, който директно отразява концентрацията на нуклеозид 5’- дифосфатите в средата. Така например, ако в средата има 5 части АДФ и 1 част СТР, 5/6 от нуклеотидните остатъци при получения полимер ще са аденилат, а останалата 1/6 – цитидилат. Този полимер ще има много триплети с последователност ААА, малък брой ААС, АСА, САА, още по-малко АСС, ССА и САС и съвсем малко ССС. С използването на разнообразни изкуствени иРНКи получени по този начин от различни стартови смеси от АDP, GDP, UDP и СDP, е идентифициран базовият състав на триплетите за почти всички аминокисеслини. Това обаче, не дава информация за последователността на базите в триплетите. (5 части АДФ и 1 част СТР) Полинуклеотид фосфорилаза ААА ААА > ААС АСА САА> АСС ССА и САС > ССС ССС „ Cracking the Code”подходи за дешифриране на кода

12 През 1964 Ниренберг и Ледер установяват, че изолирани рибозоми от Е. coli свързват специфични аминоацил-тРНК в присъствието на съответен синтетичен полинуклеотид. Например рибозоми, инкубирани с поли (U) и фенилалнил-тРНК Phe свързват и двете РНКи, но при инкубиране с поли (U) и друга аминоацил-тРНК, последната не се свързва, тъй като не разпознава UUU триплетите. Дори три нуклеотидa могат да осигурят специфично свързване на точната тРНК, така, че тези експерименти могат да се проведат с химично синтезирани малки олигонуклеотиди. С помощта на тази техника са определени аминоацил-тРНК, свързващи 50 от всичките 64 възможни кодона. За някои кодони се свързват или повече от една аминоацил- тРНК или нито една и е била необходима друга технология. UUUUUUUUUUUU Фенилаланин Триптофан X „ Cracking the Code”подходи за дешифриране на кода

13 Рамката на четене се определя, когато транслацията започне и кодоните се транслират без припокриване или разделяне, докато рибозомният комплекс достигне терминален кодон. Най-често другите две рамки на четене не съдържат полезна информация. Съществуват гени, конструирани по такъв начин, че рибозомите в определена точка на транслацията сменят рамката на четене. Това е механизъм, чрез който се дава възможност два или повече белтъка да се образуват от един транскрипт или да се регулира транслацията. Пример е вирусът на саркомата на Роус. При него гените gag и pol се припокриват. Рамката на четенe за pol е изместена наляво с 1 базова двойка (-1 рамка на четене) спрямо тази за gag. Продуктът на pol (обратна транскриптаза (ОТ)) се транслира като голям полипротеин на същата иРНК, която се използва за gag. От gag-pol полипротеинът се формира зряла ОТ чрез протеолиза. За да се формира полипротеина, е необходима промяна на рамката на четене в участъка на припокриване, който да позволи на рибозомата да прескочи стоп-кодона в края на gag гена. Промяна в рамката на четене възниква при около 5% от транслациите на тази мРНК и gag-pol полипротеина се синтезира с честота 1/20 от честотата на gag. Това ниво на транслация задоволява нуждите за ефективна репродукция на вируса Генетичен код

14 секвенциите аминокиселинна секвенция Генетичният код описва как секвенциите от нуклеотиди се превръщат в аминокиселинна секвенция по време на белтъчната синтеза. единици триплет Секвенцията на ДНК в гена е разделена на серия от единици, съставени от три бази. Всяка комбинация от три бази се нарича кодон (триплет) и определя дадена аминокиселина. 4 3 = 64 кодона Четирите бази в ДНК или в РНК могат да дадат максимална комбинация от 4 3 = 64 кодона, които определят 20 аминокиселини в белтъка (Таблица 1). Тъй като броят на кодоните е по-голям, всички АК с изключение на метионин и триптофан, се кодират от повече от един кодон. Тази особеност на генетичния код се означава като изроденост

15 Генетичен код Кодоните, които определят една и съща АК се наричат синонимни и са сравнително сходни. Например всички кодони ACU, ACC, ACA и ACG определят АК треонин. Разликите в кодоните са само в базата на трета позиция, която се означава люлееща позиция (wobbling). Изродеността на кода намалява ефекта от мутациите, така че промените в секвенцията на ДНК имат по-малък шанс да променят секвенцията на АК в белтъка и да променят неговата функция. От всичките 64 кодона 61 са за кодиране на АК. Останалите три, UAG, UGA и UAA не кодират АК, а служат като сигнали за спиране на белтъчната синтеза и са известни като терминиращи кодони. Кодонът за метионин, AUG (GUG), служи като сигнал за начало на транслацията и се нарича иницииращ кодон. Това означава, че всички белтъци започват с метионин, макар, че понякога тази АК се премахва.

16 Първа позиция (5’-край) Втора позицияТрета позиция (3’-край) UCAG UCAGUCAG Phe UUU Phe UUC Leu UUA Leu UUG Leu CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Ile AUU Ile AUC Ile AUA Met AUG Val GUU Val GUC Val GUA Val GUG Ser UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Pro CCU Pro CCC Pro CCA Pro CCG Thr ACU Thr ACC Thr ACA Thr ACG Ala GCU Ala GCC Ala GCA Ala GCG Tyr UAU Tyr UAC Stop UAA Stop UAG His CAU His CAC Gln CAA Gln CAG Asn AAU Asn AAC Lys AAA Lys AAG Asp GAU Asp GAC Glu GAA Glu GAG Cys UGU Cys UGC Stop UGA Trp UGG Arg CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Ser AGU Ser AGC Arg AGA Arg AGG Gly GGU Gly GGC Gly GGA Gly GGG UCAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAG Съвременният генетичен код (Таблица 1).

17 Генетичен код

18 Рамки на четене Иницииращият кодон не само определя старта на белтъчната синтеза, но дефинира и рамката на четене (reading frame) в секвенцията на РНК. В зависимост от това коя база е избрана за начало на кодона има три възможни комбинации от кодони, които могат да се прочетат от базовата секвенция. На практика само една от тези рамки има смислена информация за синтез на белтък; другите две рамки обикновено водят до стоп-кодони, което не позволява използването им за пряка синтеза на белтък. Рамка на четене 1: 5’ AUG ACU AAG AGA UCC GG -3’ Met Thr Lys Arg Ser Рамка на четене 2: 5’A UGA CUA AGA GAU CCG G -3’ Stop Leu Arg Asp Pro Рамка на четене 3: 5’ AU GAC UAA GAG AUC CGG -3’ Asp Stop Glu Ile Arg Всяка секвенция ДНК може да бъде четена в три отделни рамки, в зависимост от това от коя база започва кодона.

19 ГЕНЕТИЧНИЯТ КОД Е УНИВЕРСАЛЕН - при почти всички организми едни и същи кодони детерминират подреждането на едни и същи аминокиселини. При най-различни организми (вируси, прокариоти и еукариоти) свързването на определени аминокиселини се кодира от едни и същи кодони. При опити с безклетъчни системи, които съдържат рибозоми и иРНК от различни организми, специфичността на синтезираните продукти се детерминира от принадлежността на използваната тРНК. Така например в безклетъчна система с тРНК, изолирана от E. coli, и с иРНК и рибозоми, получени от ретикулоцити на заек, се синтезира хемоглобин на заек, идентичен с хемоглобина, получен с помощта на тРНК от ретикулоцити на заек. Следователно, антикодоните на тРНК на бактериите и на бозайниците са еднакви и могат да се свързват с кодоните на иРНК на животни и да участват в биосинтезата на специфични белтъчини като хемоглобина. Свойства на генетичният код Ретикулоцитите се образуват в костния мозък. Те са млади еритроцити – преходен стадий в развитието на червения кръвен ред – от оксифилен еритробласт към зрял еритроцит.

20 ИЗКЛЮЧЕНИЯ ОТ УНИВЕРСАЛНОСТТА Изключение от универсалността на генетичния код се наблюдава само при митохондриите, които имат свой собствен наследствен апарат, обособен от ядрото на клетката. При тях някои кодони функционират различно от кодоните в клетките на всички видове организми. Така безсмисленият при клетките кодон УГА в митохондриите кодира включването в полипептидната верига на аминокиселината триптофан, а кодиращият свързването на левцина в клетките кодон ЦУГ при митохондриите кодира включването на аминокиселината треонин. Свойства на генетичният код

21 Гените детерминират характерните свойства на белтъчините на базата на колинеарността, т.е. паралелното съответствие между структурата на гена и структурата на кодираната от него полипептидна верига. Последователността на нуклеотидите в участъка на ДНК, в който е локализиран даден ген, определя подреждането на аминокиселините в контролираната от него полипептидна верига. Доказателства за колинеарността между структурата на гена и на белтъчината са получени чрез създадените за целта мутационни модели. Нормалната триптофансинтетаза А на E. coli съдържа 267 аминокиселинни остатъка. При облъчване с ултравиолетови лъчи възникват мутации в кодиращият и ген. С помощта на рекомбинационен анализ е доказано, че положението на засегнатите от мутациите нуклеотиди в гена на триптофансинтетазата А напълно съответстват на местата на изменените аминокиселини в съответните мутантни белтъчини. Следователно, съществува колинеарност между последователността на нуклеотидите в гена trpA на E. coli и последователността на аминокиселините в кодираният от него белтък. Колинеарност между гена и белтъчините

22 Както се спомена, между нуклеотидите и аминокиселините няма пространствено сродство. Нужен е адаптор, който да има сродство и към кодоните, и към аминокиселините. Този адаптор е тРНК. Към 3’- края й се свързва аминокиселината. В съвсем друга част на молекулата има 3 съседни нуклеотида, комплементарни на кодона. Този триплет в тРНК се нарича антикодон. тРНК са малки (около 80 нуклеотида). За разлика от другите РНК функционират сами, а не се свързват с белтъци в нуклеопротеинови комплекси. Както знаем, измежду всички РНК тРНК са най-богати на модифицирани нуклеотиди. Някои от тях са нужни, за да заеме молекулата необходимата за функциите й структура, а други най-вероятно просто осигуряват защита от рибонуклеази. Транспортна РНК

23 Роля в транслацията Клетките съдържат oсновно три вида РНК – транспортна, рибозомна и информационна; транскрибират се от ДНК. Транспортната и рибозомната РНК са част от апарата на белтъчната синтеза, а иРНК участва като матрица за синтеза на белтъци по време на транслацията. Транспортните РНК (тРНК) са малки молекули, които действат като адаптери по време на белтъчната синтеза. Те са връзката между нуклеотидната секвенция на иРНК и аминокиселинната секвенция на белтъка. Клетките съдържат определен брой тРНК, всяка от които може да се свързва само с определена аминокиселина (АК). Всяка тРНК различава един кодон в иРНК, което ú позволява да поставя АК на правилна позиция в растящата полипептидна верига, както е определено от секвенцията на иРНК.

24 Модифицирани нуклеотиди в тРНК Модифицирани нуклеотиди в тРНК На фигурата е показана обобщената вторична структура на тРНК. Поради формата си тя се нарича детелинов лист. Двуверижните участъци заемат голям дял в молекулата. Т. нар. допълнителна бримка силно варира не само по състав, а и по дължина. Останалата част от молекулата е по- консервативна. Оформя 4 рамена: акцепторно, псевдоуридиново, антикодоново и дихидроуридиново. Акцепторното рамо включва двата свободни края, а в другите три рамена веригата се огъва, образувайки бримки

25 Транспортна РНК – структура. Функция на раменете. Акцепторно рамо. Секвенцията ССА, която се намира на 3’-края на веригата на всички тРНК е несдвоена с други нуклеотиди и нуклеотида А е мястото на свързване на аминокиселината. D-рамо (или DHU) е структура стъбло-бримка, съдържащо дихидроурацил (D) нуклеотид с модифицирана азотна база. Антикодоново рамо, отговорно за разпознаването и свързването на кодона в иРНК. Комплементарен на кодона. Допълнително или вариабилно рамо. Може да е малко, съдържащо само 2-3 нуклеотида (клас I тРНК) или по- голямо, съдържащо 13-21 нуклеотида (клас II тРНК). ТψС рамо - съдържа секвенцията ТψС, където с ψ (пси) се означава необичайният, модифициран нуклеотид псевдоурацил.

26 Транспортна РНК – 3D структура – L - форма двуизмерната форма Детелиновият лист е двуизмерната форма на тРНК. рентгено- структурен анализ Триизмерната структура (3D) е получена от данни от рентгено- структурен анализ (фигурата). Нуклеотидите, свързани в 2-D структура са свързани и с некомплементарни водородни връзки между нуклеотиди, които са раздалечени и са на различни рамене като те образуват 3D структурата.

27 Транспортна РНК – 3D структура – L - форма Тези връзки се наричат третични, тъй като образуват третичната структура на тРНК. консервативни Много от тези нуклеотиди са консервативни или полу- инвариантни. противоположните В 3D структурата акцепторното рамо и антикодоновото рамо са на противоположните краища на молекулата в съответствие с различната им функции в транслацията

28 3D структура; L–форма на тРНК http://www.youtube.com/watch?v=Zzg1MDoAWLA http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/TRNA http://higheredbcs.wiley.com/legacy/college/boyer/04716617 91/structure/tRNA/trna.htm

29 Аминокиселините се активират рано, още преди да се реши за кой белтък ще се използват. Реакцията се катализира от ензимите аминоацил-тРНК- синтетази, често наричани за по-кратко активиращи или натоварващи ензими. Активиращите ензими плуват в цитозола без пряка връзка с рибозомите или мРНК. Бактериите имат по една синтетаза за всяка аминокиселина. Общо взето, така е и при еукариотите, макар че в отделни случаи за една аминокиселина има повече от един ензим. Активиращи ензими

30 Трябва да се подчертае, че активиращият ензим не само повдига енергетичното ниво на аминокиселината, а и урежда срещата й с тРНК. Сама тРНК никога не би разпознала своята аминокиселина – 3’-краят на тРНК не е нагоден за такава сложна работа и е винаги еднакъв (ЦЦА). Без да имат пространствено сродство една към друга, тРНК и аминокиселината се събират благодарение на ензима, който има пространствено сродство и към двете. При това се разпознава не някакъв определен малък участък от тРНК, а цялостната й структура. Макар че функцията на тРНК е адапторна, без ензима тРНК би имала същия неуспех в разпознаването на аминокиселината, както и самата мРНК. Следователно аминоацил-тРНК-синтетазата е втори адаптор на транслацията с не по-малко важна роля от първия адаптор тРНК.