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MUTACIONES
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¿Cómo surgen las variantes genéticas
en la naturaleza? Mutación: Proceso por el que un gen cambia de una forma alélica a otra. Mutación versus Reversión
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Las mutaciones pueden afectar:
Región promotora Región codificante Las mutaciones pueden generar: Pérdida de función Ganancia de función
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En organismos diploides las mutaciones de pérdida de función generalmente son recesivas
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Mutaciones en la región reguladora de un gen pueden provocar pérdida o ganancia de función
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A nivel del ADN las mutaciones pueden ser originadas por:
Sustituciones Transiciones : A G (purinas) ; C T (pirimidinas) Transversiones: purina pirimidina Inserciones Deleciones Impedimento físico
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A nivel de la proteína las mutaciones pueden ser:
A) Mutación silenciosa (AGG -> CGG ambos determinan Arg) B) Mutación de cambio de sentido - Sinónima (AAA Lys -> AGA Arg ambos aa básicos) - No sinónima (UUU Phe hidrofobico -> UCU Ser polar) C) Mutación sin sentido (CAG Gln -> UAG Stop) D) Mutación de cambio del marco de lectura (o de cambio de fase) E) Reversiones - Exacta (AAA Lys -> GAA Glu -> AAA Lys) - Equivalente (UCC Ser -> UGC Cys -> AGC Ser) (CGG Arg -> CCC Pro -> CAC His)
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Mutaciones de cambio en el marco de lectura
GCU Ala Ala Ala Ala Ala Ala Silvestre GCU Ala Ala Ser Cys Cys Cys AGC UGC UGC UGC A Inserción GCU Ala Ala Ala Ala Leu Leu CUG CUG G Deleción
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Las mutaciones se producen en forma:
Espontánea: Causas: * Errores en la replicación (fidelidad ADN pol, tautomeri- zación de bases) * Lesiones espontáneas (Deaminación) Inducida: Agentes mutagénicos * Biológicos * Físicos * Químicos
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Las mutaciones se producen en el ADN y se heredan a las células hijas durante la división celular
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Mecanismos que aseguran la fidelidad de la
ADN polimerasa
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Tautomerización
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Tautomerización de bases
Emparejamiento normal entre las formas “ceto” (y “amino”) de las bases Emparejamientos erróneos causados por las formas tautoméricas raras de las bases
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Ejemplo de transición provocada por la aparición de la forma enol de G durante la replicación
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Deaminación Además: Deaminación de G -> xantina, bloquea la replicación (no mutagénica) Deaminación de A -> hipoxantina, empareja con C en lugar de T
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Agente Efecto en células vivas
Carcinogénico Causa cáncer (transformación neoplásica de células eucarióticas) Clastogénico Causa fragmentación de cromosomas Mutagénico Causa mutaciones (puede producir todos los otros efectos) Oncogénico Induce a la formación de tumores Teratogénico Produce anormalidades en el desarrollo
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Mutágenos Biológicos Físicos Químicos Transposones, virus
Radiación UV, Rayos X Químicos Análogos de bases (5-bromo uracilo, 2-aminopurina) Agentes intercalantes (naranja de acridina) Agentes alquilantes (etilmetanosulfonato, nitrosoguanidina)
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Transposones Secuencia de inserción ADN receptor
TC CTCTGCC AGGAGACGG Transposasa Repeticiones terminales invertidas Transposones
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Mecanismos de acción generales de los mutágenos físicos y químicos:
a) Sustitución de bases b) Modificación de bases c) Agentes intercalantes d) Impedimento físico
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Mecanismo de sustitución de bases
5-Br-uracilo (enol) 2-aminopurina
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Mecanismo de modificación de bases
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Mutágenos del tipo agentes intercalantes
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Impedimento físico: formación de aductos
Fotoproductos generados por la luz UV
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Mutación somática versus mutación germinal
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Mecanismos de reparación
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Reversión del daño * Fotorreparación * Ligamiento de rupturas simple hebra Remoción del daño * Reparación por escisión de bases * Reparación de “mismatch” Tolerancia al daño * Reparación por recombinación * Reparación mutagénica
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Reparación de fotodímeros de pirimidina por fotoliasa y luz blanca
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ADN ligasa sella los enlaces fosfodiester interrumpidos
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La glicosilasa remueve la base dañada, el sitio AP es reconocido por una endonucleasa y, ayudada por una exonucleasa escinde un fragmento de ADN que es rellenado por ADNpol I y sellado por la ligasa
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¿Cómo identifica la célula la hebra recién sintetizada para saber cuál es, probablemente, la base “mutante” en un mal apareamiento?
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Escisión frente a un aducto
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Reparación mutagénica
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Fenotipos mutantes A) Mutaciones morfológicas B) Mutaciones letales
C) Mutaciones bioquímicas D) Mutaciones condicionales
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sus genes y la secuencia histórica de
El fenotipo de un individuo es una consecuencia de la interacción entre sus genes y la secuencia histórica de las condiciones ambientales a las que ha estado expuesto. Mutaciones
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Mutagénesis como herramienta de mejoramiento genético de microorganismos
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Objetivo de la biotecnología de microorganismos
Cepas altamente productoras: Mejoramiento genético Simple selección Manipulación genética Mutagénesis al azar y selección sitio dirigida Variabilidad intra-específica
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EJEMPLO: Ruta de biosíntesis del -caroteno
GGPP Fitoeno sintetasa Prefitoeno pirofosfato Fitoeno Fitoeno desaturasa Licopeno Licopeno ciclasa Genes!!!!! -caroteno
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Mutación de una secuencia reguladora en cis
Ejemplos de mutaciones que pueden inducir a la sobreproducción de un producto (deseable en biotecnología): Mutación de una secuencia reguladora en cis Mutación del gen que codifica para un elemento regulador en trans Elementos reguladores en trans o factores de transcripción específicos Represor Factores de transcripción generales
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Estandarización de las condiciones de mutagénesis
Cultivo en fase exponencial Fuente UV (254 nm) Oscuridad por 24 h Dilución seriada Plaqueo en medio sólido Conteo de colonias Determinación del tiempo de exposición que provoca 95 a 99% de mortalidad
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Mutagénesis y selección
Oscuridad por 24 h Dilución seriada Plaqueo en medio sólido Control Condición de selección Clones seleccionados Re-chequeo Determinar la fijación de la mutación Caracterización
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Clones mutantes de Tetraselmis suecica sometidos a selección en presencia de Cerulenina, un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos Control Cerulenina 2 g/ml Mutantes potencialmente mejorados en su capacidad de acumular PUFAs
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