INMUNOHEMATOLOGIA BASICA

Presentación del tema: "INMUNOHEMATOLOGIA BASICA"— Transcripción de la presentación:

1 INMUNOHEMATOLOGIA BASICA

2 Sistema Rh Gloria Eugenia Barco A. Coordinadora Banco de Sangre
Hospital Pablo Tobón Uribe Medellín - Colombia

3 Objetivos del aprendizaje
Hacer una revisión del Sistema Rh, su evolución a lo largo de la historia y la importancia de éste en la inmunohematología debido al elevado poder inmunogénico de sus antígenos (especialmente el D).

4 Agenda Historia del Sistema Rh Definición Significado clínico
1 Historia del Sistema Rh 2 Definición 3 Significado clínico 4 Consideraciones bioquímicas y genéticas 5 Variantes del Rh

5 El Sistema Rh es uno de los sistemas más polimórficos e inmunogénicos conocido en los humanos

6 Historia del Sistema Rh
1939 Historia del Sistema Rh Levine y Stetson Suero de la madre de un niño con EHRN que presentó una reacción hemolítica luego de recibir una transfusión de sangre de su esposo.

7 Historia del Sistema Rh
1940 Historia del Sistema Rh Landsteiner y Wiener Describieron anticuerpos desarrollados en cobayos y conejos inmunizados con eritrocitos de monos Rhesus. Karl Landsteiner Estos anticuerpos aglutinaban los glóbulos rojos del 85% de las personas evaluadas y lo llamaron FACTOR Rh.

8 Factor Rh De forma positiva Produciendo aglutinación de hematíes
La inicial Rh corresponde al Macaco Rhesus, un mono cuya sangre tiene la propiedad de poseer un factor aglutinógeno de glóbulos rojos al que unas personas responden, en caso de transfusión. De forma positiva Produciendo aglutinación de hematíes De forma negativa En los que el suero Rh no genera la aglutinación de los glóbulos rojos Rh negativo Rh positivo

9 Historia del Sistema Rh
1940 Historia del Sistema Rh Levine y Katzin Encontraron anticuerpos similares en el suero de varias puérperas y en por lo menos uno, registraron reacciones equivalentes a las de los sueros animales anti Rhesus. Macacus Rhesus

10 Alexander Solomon Wiener
1940 Historia del Sistema Rh Wiener y Peters Advirtieron anticuerpos de igual especificidad en el suero de individuos cuyos glóbulos rojos carecían del determinante y que habían recibido transfusiones ABO compatibles en el pasado. Alexander Solomon Wiener

11 Mas tarde… se estableció…
Antígenos detectados por los sueros anti-Rhesus animales Antígenos detectados anti-D humano Pero…. el sistema de grupo sanguíneo Rh ya había recibido ese nombre…

12 Poco después……. De descubrir los anti-D, estudios familiares demostraron que los antígenos D son rasgos genéticos que se transmiten de forma autosómica dominante.

13 Significado clínico En MEDICINA TRANSFUSIONAL, los D son los antígenos eritrocitarios más importantes después de los A y B. Las personas que carecen de antígenos D no siempre producen los anticuerpos correspondientes.

14 Significado clínico Formación de anti-D Gestación Transfusión
Con antígeno D Formación de anti-D

15 Los más inmunogénicos Entre el 30 y el 85
Que los demás antígenos eritrocitarios Transfusión Entre el 30 y el 85 Desarrollan anti-D

16 D negativo Para evitarlo…
Se evalúan los antígenos D en la sangre de todos los receptores y donantes para asegurar que todos los receptores D negativo reciban sangre. D negativo

17 Pertenecientes al actualmente llamado sistema Rh
Otros antígenos importantes 4 C E c e Pertenecientes al actualmente llamado sistema Rh 5 D C E c e Y sus anticuerpos correspondientes son los responsables de la gran mayoría de los eventos clínicos que involucran al sistema Rh.

18 Consideraciones bioquímicas y genéticas
Las hipótesis para explicar los mecanismos genéticos de la expresión de los antígenos del Sistema Rh fueron motivo de controversias científicas entre los investigadores.

19 Estos alelos son llamados “HAPLOTIPOS”
Fisher y Race postulan que en el cromosoma 1 existen 3 locus estrechamente relacionados 1943 “D” “C” “E” Con dos pares de alelos “C” “c” “E” “e” Y el alelo del “D” que no produce antígeno y lo colocan “d” para significar su ausencia Estos alelos son llamados “HAPLOTIPOS”

20 CDe cde El haplotipo más heredado Para las personas Rh positivo
Para las personas Rh negativo

21 R r 1951 Los productos del gen HAPLOTIPO son designados:
Wiener propuso la existencia de un solo gen complejo, con alelos que resultan en varios antígenos del Rh 1951 Los productos del gen HAPLOTIPO son designados: R Para los que codifican D r Para los que no codifican

22 Terminología complicada que cayó en desuso
Rosenfield propuso un modelo genético con genes estructurales y genes operadores 1973 D 1 c 4 C 2 e 5 E La ausencia de antígeno lleva el signo negativo adelante. 3 Terminología complicada que cayó en desuso

23 Patricia Tippet propuso la teoría de la existencia de dos genes
1986 RHD RHCE Responsables de la presencia de los antígenos del sistema Rh, esta teoría fue confirmada por la clonación de ambos genes en 1990 por Colin y cols. RHD y RHCE Estudios moleculares RHCE Individuos RHD positivos Individuos RHD negativos

24 Entonces…… El locus para el RH está constituido por dos genes homólogos: RHD RHCE Compuesto por 10 exones cada uno Ubicados en el brazo corto del cromosoma 1 En la posición 1 p34-36 Distribuidos en forma de tandem (uno a continuación del otro) Con orientaciones opuestas enfrentados en su posición 3’ y separados por el gen SMP 1

25 Lleva los antígenos - RhC - Rhc
Proteínas resultantes Proteína RhD Proteína RhHCE Lleva el antígeno RhD Lleva los antígenos RhC Rhc RhE RhCE

26 Organización genómica del locus RH humano

27 “Cajas Rhesus” del gen RHD
Dos regiones de 9 kilo bases 98.6% de homología Papel primordial en la formación del haplotipo RHD negativo den la raza caucásica

28 1 2 El entrecruzamiento desigual de las “Cajas Rhesus”
La deleción del gen RHD responsable del fenotipo negativo se produjo probablemente por: El entrecruzamiento desigual de las “Cajas Rhesus” 1 De dos haplotipos RH mal alineados en trans dando lugar una “Caja Rhesus” híbrida 2

29 Recombinación genética en “trans”

30 En la población de raza negra
La variante alélica RHD Ψ, o pseudogen RHD, esta presente en un 66% de los individuos Rh (D) negativo y corresponde a un gen RHD inactivo.

31 Modelo de las proteínas Rhesus (RhD y RhCE) en la membrana del hemtatíe
Las proteínas resultantes, RhD y RhCE, son proteínas transmembrana de múltiples pasos compuestas por 417 aminoácidos. Cada uno de los exones del gen codifica par un segmento de la proteína, de manera que los 10 exones dan lugar a una proteína completa.

32 RHCE RHD “Complejo Rh” Gen RhAG RhAG (Rh50)
La presencia y funcionalidad de la proteína Gen RhAG Permiten la inserción de las proteína Rh en la membrana del glóbulo rojo y la expresión de los antígenos del sistema Rh. RhAG (Rh50) RHCE RHD “Complejo Rh”

33 La presencia y funcionalidad de la proteína
Mutaciones en el gen RHAG (Rh50) Proteínas RhAG incompletas No se integran a la membrana del glóbulo rojo No se integran las proteínas Rh Fenotipo “Rh nulo”

34 Rh nulo 1998 Se describió en la literatura por vez primera que existen personas que carecen del sistema Rh Su manifestación clínica es una anemia hemolítica crónica con macrocitosis y reticulocitosis En el año 2003 se tuvo conocimiento de un nuevo caso de una niña de la ciudad de Curitiba, Brasil llamada Leticia Laudino que pocas horas después de nacer, el 18 de octubre del mismo año, fue llevada a la Unidad de Terapia Intensiva (UTI) con un cuadro de anemia hemolítica

35 Variantes RhD FENOTIPOS D parcial D débil

36 Variantes RhD FENOTIPOS D parcial D débil

37 D parcial Los individuos portadores de este fenotipo carecían de un fragmento de proteína lo suficientemente importante como para sensibilizarse tras la exposición a un antígeno Rh (D) completo y desarrollar el correspondiente anticuerpo.

38 Bases moleculares D parcial
Las bases moleculares que explican este fenotipo pueden ser de 3 tipos: 1. Alelos híbridos RHD/RHCE 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína 3. Mutaciones puntuales dispersas

39 Bases moleculares D parcial
Las bases moleculares que explican este fenotipo pueden ser de 3 tipos: 1. Alelos híbridos RHD/RHCE 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína 3. Mutaciones puntuales dispersas

40 1. Alelos híbridos RHD/RHCE
RHD - CE - D RHCE - D - CE

41 Resultados La proteína hibrida resultante puede no expresar el antígeno Rh (D) o Ver reducida su expresión dependiendo de los exones comprometidos en la recombinación y de como ésta afecte a la configuración que resulta necesaria par la correcta expresión del antígeno Rh (D)

42 Los aa del Ag Rh(D) Prot RhD
Forman parte de la región extracelular de la proteína y están ubicados en los bucles externos 3, 4 y 6 Los aa del Ag Rh(D) Prot RhHCE Las diferencias entre las proteínas externas RhD y RhCE residen en los bucles: Prot RhD 3, 4 y 6 Codificados por Los exones 4, 5 y 7 del gen RHD

43 Gen RHD Por lo tanto… Gen híbrido Expresión alterada del AgD
Combinación en “Cis” Gen RHD Cambia los exones 4, 5 y 7 del gen RHD Por Los exones 4, 5 y 7 del gen RHCE Gen híbrido Prot. bucles 3, 4 y 6 de la prot RhCE Expresión alterada del AgD La mayoría de las categorías D parcial se explican por combinaciones de este tipo.

44 Bases moleculares de diferentes variantes RHD que determinan un fenotipo D parcial

45 Considerando que… Expresión del Rh (D) 6 posibles combinaciones
Los exones 4, 5 y 7 del gen RHD son críticos 6 alelos híbridos 6 categorías FENOTIPOS EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS DIVb Rh 37 (Evans) DVa Rh 23 (Dw) DVI Rh 52 (BARC) DFR Rh 50 (FPTT) DBT Rh 32 DHAR Rh 33 Expresión del Rh (D)

46 Antígenos de baja frecuencia
Alelos híbridos / Fenotipos parciales Antígenos expresados LOOP3 (Exón 4) LOOP4 (Exón 5) LOOP 6 (Exón 7) Fenotipos ANTÍGENOS EXPRESADOS Epítopos RhD Antígenos de baja frecuencia RhCE RhD DFR (1),(2),3,4,(5),6/7),9 FPTT (Rh50) DVa 2,3,4,6/7,8,9 Dw (Rh23) DIVb 5,6/7,8 Evans (Rh37) DVI 3,4,9 BARC (Rh52) DHar (5),(6/7) Rh33, FPTT (Rh50) DBT (6/7),8 Rh32

47 La expresión del antígeno Rh (D) puede variar entre alelos pertenecientes a una misma categoría, al igual que la reactividad frente a diferentes anticuerpos anti-Rh (D) dependiendo de la densidad antigénica de las proteínas resultantes.

48 DIII DIIIa DIIIb DIIIc Los fenotipos parciales
Son proteínas híbridas, pero los alelos que las produjeron no son resultado de combinaciones de los exones 4, 5 y 7, sino de otros exones que no afectan los bucles 3, 4 y 6 de la proteína del RhD.

49 D IIIb D IIIc Los fenotipos parciales Bucle 2 del Exón 2 del Gen RHD
Bucle 2 del Exón 2 del Gen RHCE D IIIb Bucle 3 del Exón 3 del Gen RHD Bucle 3 del Exón 3 del Gen RHCE D IIIc

50 Los individuos D IIIc, se inmunizan contra antígenos RhD completos.
Esto significa que cambios en la estructura peptídica de la proteína, pueden afectar bucles extracelulares y crear nuevos epítopos antigénicos.

51 Intervalo

52 Bases moleculares D parcial
Las bases moleculares que explican este fenotipo pueden ser de 3 tipos: 1. Alelos híbridos RHD/RHCE 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína 3. Mutaciones puntuales dispersas

53 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína
Mas de 10 fenotipos D parcial son debidos a mutaciones puntuales localizadas en los bucles extracelulares. Las proteínas resultantes son muy diversas y el grado de expresión del antígeno Rh (D) difiere dependiendo de: La localización El tipo de sustitución

54 DVII DNB Fenotipos parciales - Mutaciones puntuales
Los que más se inmunizan cuando reciben sangre RhD positivo son: Expresa el antígeno Rh 40 (Tar) Cambio de aa Leucina por Prolina en la posisición 110 del bucle 2 de la proteína RhD. DVII Cambio de aa de Glicina por Serina en la posición 355 del bucle 6. DNB

55 Bases moleculares de diferentes variantes RHD que determinan un fenotipo D parcial

56 AMINOACIODOS SUSTITUÍDOS
Fenotipos parciales - Mutaciones puntuales LOOPS EXTERNOS POSICIONES DE LOS AA AMINOACIODOS SUSTITUÍDOS FENOTIPOS 1 54 Leu Pro DMH 2 Ser Pro G (neg RhD) DVII (Tar Rh40) 3 166 His Pro DFW 4 Arg Lys Glu Lys Arg Trp Lys Thr DHR DHK DYU DHO 5 283 285 Thr Ile Cys Tyr DHM DIM 6 353 354 355 358 Gly Arg Ala Asp Gly Ser Met Thr DNU DII DNB DWI

57 Bases moleculares D parcial
Las bases moleculares que explican este fenotipo pueden ser de 3 tipos: 1. Alelos híbridos RHD/RHCE 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína 3. Mutaciones puntuales dispersas

58 DIIIa DIIItipo IV DIVa DAR 3. Mutaciones puntuales dispersas
Numerosos fenotipos D parcial son fruto de múltiples mutaciones puntuales ubicadas en diferentes regiones de la proteína RhD. Por ejemplo: DIIIa DIIItipo IV DIVa DAR Pueden estar asociadas a otras mutaciones responsables de categorías bien definidas de D parcial o a otras variantes alélicas

59 Anti-epD1 a anti-epD9 Categorías del antígeno RhD
Los antígenos RhD parciales fueron inicialmente clasificados en categorías: en función de la presencia o ausencia de 9 epítopos presentes en el antígeno Rh Determinados por reacciones de aglutinación de los glóbulos rojos cuando eran testados contra anticuerpos monoclonales. Anti-epD1 a anti-epD9 epD: epítope del RhD

60 Categorías de antígenos D parcial
EPÍTOPOS PRESENTES epD1 epD2 epD3 epD4 epD5 epD6 epD7 epD8 epD9 II + - IIIa IIIc IV a(Goa) IV b V a (Dw) VI VII (Tar) DFR Por esta batería de pruebas con 9 anticuerpos monoclonales (Mo) contra epítopos del Rh podemos observar que el RhD categoría VI (DVI) solo presenta 3 epítopos del RhD.

61 En un estudio posterior…
Realizado con 30 anticuerpos monoclonales se verifico que la categoría DVI solo presenta 6 epítopos propios del Rh D. CATEGORÍAS NEGATIVOS POSITIVOS II 5 25 IIIa-IIIc 30 IIIB 1 29 IVa 10 20 IVb 11 19 Va 8 22 VI 24 6 VII 3 27 D parciales 30 epítopos Las pruebas negativas (24) significan que estos epítopos del RhD están ausentes porque fueron reemplazados por epítopos del RhCE.

62 RhD parcial categoría VI
Conclusión RhD parcial categoría VI El fenotipo es el de más alta Frecuencia entre los D parciales y por la ausencia de la mayoría de los individuos DVI se inmunizan fácilmente cuando son transfundidos con sangre Rh positivo, produciendo anticuerpos contra los epítopos ausentes. los epítopos del RhD Un kit con 6 sueros monoclonales contra epítopos del RhD, pueden indentificar las categorías más importantes entre RhD parciales

63 Variantes RhD FENOTIPOS D parcial D débil

64 D débil Objeto de discusión y controversia
La información actual disponible ponen de manifiesto su HETEROGENEIDAD Bajo este término se han ido incluyendo una amplia variedad de fenotipos D de expresión débil Difícil establecer protocolos frente a los diversos fenotipos D débil

65 ¿Cómo se explica el D débil?
Gen RHD Mutaciones puntuales del cambio de aa en la región transmembrana o intracelular.

66 Afectar su interacción con la glicoproteína RhAG (Rh50)
Aunque…. Estos cambios de aa no son inmunogénicos pueden: Dificultar la inserción de la proteína RhD en la membrana del glóbulo rojo Afectar su interacción con la glicoproteína RhAG (Rh50) Fenotipo D débil

67 Fenotipos RhD débil Diversos tipos de RhD débiles han sido descritos de acuerdo con las posiciones de cambios de aminoácidos. La numeración usada es de acuerdo a la frecuencia en que aparecen en la población, siendo los números mas bajos, los más frecuentes.

68 AMINOACIODOS SUSTITUÍDOS
Fenotipos RhD débil TIPOS DE RhD débil POSICIONES DE LOS AA AMINOACIODOS SUSTITUÍDOS LOCALIZACIÓN 1 270 Val Gly Transmembrana 2 385 Gly Ala 3 Ser Cys Intracelular 4.0 Thr Arg Phe Val 4.1 Trp Cys Thr Arg Phe Val 4.2 Ile Thr 5 149 Ala Asp 11 295 Met Ile 15 282 Gly Asp 20 417 Phe Ser Los fenotipos D débil de los tipos 1 al 4 representan más del 90% de los fenotipos D débil detectados en europeos. El D débil tipo 4 se ha dividido a su vez en varios subtipos.

69 DEL Del Fenotipos RhD débil La forma más débil corresponde al fenotipo
El fenotipo DEL es el menos frecuente DEL Del La expresión del antígeno es tan extremadamente débil que solo puede demostrarse con técnicas de adsorción elución 30% de los donantes son portadores de un fenotipo DEL ligado a la variante RHD

70 D parcial D débil Fenotipos Mas similitudes que diferencias
Fronteras virtuales

71 Representación de variables cualitativas y cuantitativas del antígeno RhD en la membrana del glóbulo rojo

72 Cuantitativamente normal
Términos importantes Concentración de sitios antigénicos normal (entre y sitios por membrana de glóbulo rojo). Cuantitativamente normal Presenta todos los bucles externos típicos del Rh, con todos sus epítopos. Cualitativamente normal

73 Cuanti normal y cuali anormal
RhD normal Cuanti y cuali normal Concentración de sitios antigénicos normal y además el RhD presenta los bucles externos típicos con todos sus epítopos RhD débil Cuanti y cuali normal Concentración reducida de sitios antigénicos, pero la prot no presenta cambios y todos los epítopos del RhD están presentes Antiguo Du RhD parcial Cuanti normal y cuali anormal Concentración normal, pero la prot RhD es una variante cuali con epítopos antigénicos no típicos, incorporados del RhCE RhD parcial débil Cuanti y cuali anormal Concentración reducida de sitios antigénicos y con epítopos antigénicos no típicos del RhD

74 Significado de los antígenos D débil - D parcial
La estrategia ideal en donantes sería el uso de un reactivo anti D capas de aglutinar directamente a la mayoría de los antígenos D. Por lo que tenemos que utilizar más de un reactivo y en última instancia utilizar la técnica de la antiglobulina para confirmar el RhD.

75 RhD+ Qué hacer… Como lo sugieren los estándares de la AABB:
Analizar la expresión débil del antígeno D en las muestras de los donantes de sangre y en caso de ser positivo se debe rotular la unidad como. RhD+

76 RhD negativo Qué hacer…
La estrategia más adecuada para el tipaje Rh (D) de pacientes y gestantes es la que está fundamentada sobre: La información existente El sentido común Recursos disponibles Para los receptores se establece el uso de un anti-D monoclonal de tipo IgM que no aglutine a las variantes DVI. Y que los portadores de esta variante sean catalogados como: RhD negativo

77 Rosenfields Numerical ISBTs Numerical
Nomenclatura Sistemas de nomenclatura han sido desarrollados para transmitir la información genética y serológica del sistema Rh. Fisher- Race Wiener Rosenfields Numerical ISBTs Numerical

78 Conclusiones El sistema Rh es uno de los sistemas más polimórficos e inmunogénicos conocido en los humanos Es el más importante en la práctica transfusional después del sistema ABO A pesar de la evolución, aún nos queda mucho por definir

79 Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M, eds Blood transfusion in clinical medicine. 10th ed. Oxford Blackwell Science, 1997: Eduardo Muñiiz Díaz, C Canals Surís, R Montero Tejedor, N Nogués Galvez. Laboratorio de Inmunohematología. Banc de Sang i Teixits. Barcelona. Importancia Clínica de las variantes RH (D) en pacientes, donantes y gestantes Connie M. Westhoff, SBB, PhD. The structure and function of the Rh antigen Complex. NIH National Institutes of Health Manual técnico AABB capítulo 14 Sistema Rh

80 Gracias… gbarco@hptu.org.co
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