Dra. Alicia Cuesta. Consultora Internacional de la FAO

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1 Dra. Alicia Cuesta. Consultora Internacional de la FAO
ACREDITACIÓN DE LABORATORIOS DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Requisitos Técnicos Dra. Alicia Cuesta. Consultora Internacional de la FAO

2 Introducción Los ENSAYOS MICROBIOLOGICOS de alimentos:
Poseen particularidades que los diferencian de los físico-químicos. Incluyen: Ensayos de esterilidad, detección, aislamiento, recuento e identificación de microorganismos y sus metabolitos. A diferencia de las ciencias químicas y físicas, en microbiología se trabaja con microorganismos que se multiplican por división binaria y crecen exponencialmente. Esto les infiere características particulares. Los ensayos microbiológicos incluyen ensayos de esterilidad, detección, aislamiento, recuento e identificación de microorganismos y sus metabolitos.

3 Operaciones críticas Las operaciones importantes a considerar en microbiología son: La preparación de los medios de cultivo y su esterilización El procedimiento de siembra e incubación (incluye aquí la temperatura como parámetro crítico) Control de la calidad de los medios de cultivo. Personal capacitado para la realización de cada actividad. Lectura de placas Validación de los métodos de ensayo. Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo. Monitoreo ambiental. Las operaciones que se realizan dentro del laboratorio de microbiología pueden dividirse en aquellas que son críticas para la calidad de resultados del ensayo y aquellas que tienen un menor impacto. Las operaciones críticas deben ser controladas, monitoreadas y documentadas. Las operaciones importantes a considerar en microbiología son: a) La preparación de los medios de cultivo y su esterilización b) El procedimiento de siembra e incubación (incluye aquí la temperatura como parámetro crítico) c) Control de la calidad de los medios de cultivo. d) Personal capacitado para la realización de cada actividad. e) Lectura de placas f) Validación de los métodos de ensayo. g) Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo. h) Monitoreo ambiental.

4 Factores que determinan la exactitud y confiabilidad de los ensayos
Los factores que determinan la exactitud y confiabilidad de los ensayos realizados en el laboratorio se detallan a continuación: Factores humanos. Relativo a las instalaciones y condiciones ambientales. De los métodos de ensayo y validación de los métodos. De los equipos. De la trazabilidad de las mediciones. Del muestreo. Del manipulación de las muestras. Estos factores contribuirán en diferente grado a la incertidumbre total de la medición. El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al desarrollar los métodos y procedimientos del ensayo, en la capacitación y calificación del personal, así como en la selección y calibración de equipos utilizados. Los factores que determinan la exactitud y confiabilidad de los ensayos realizados en el laboratorio se detallan a continuación: Factores humanos. Relativo a las instalaciones y condiciones ambientales. De los métodos de ensayo y validación de los métodos. De los equipos. De la trazabilidad de las mediciones. Del muestreo. Del manipulación de las muestras. Estos factores contribuirán en diferente grado a la incertidumbre total de la medición. El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al desarrollar los métodos y procedimientos del ensayo, en la capacitación y calificación del personal, así como en la selección y calibración de equipos utilizados.

5 Personal COMPETENCIA TECNICA
Descripción de actividades y responsabilidades Calificación básica PERSONAL DE CONDUCCIÓN PERSONAL TÉCNICO PERSONAL TÉCNICO DE APOYO Supervisión adecuada CAPACITACION: Identificación de las necesidades de formación Planificación de la formación. Realización de la formación Documentación. 2.1 Competencia técnica: A) La dirección del laboratorio debe asegurar la competencia del personal que participa en la realización del ensayo, opera equipos, evalúa los resultados y firma los informes de ensayos. B) Cuando emplea personal en formación debe proveer adecuada supervisión. C) La dirección debe autorizar al personal que realiza una determinada tarea; como ser realizar muestreo, el ensayo, emitir el informe, operar equipos, realizar interpretaciones. D) El laboratorio debe conservar los registros: De la autorización para realizar una dada actividad. Competencia del personal y la fecha a partir de la cual se autorizó E) La dirección debe definir los requisitos mínimos de nivel de estudio, calificación y experiencias necesarias para las personas que ocupan puesto de trabajo clave en el laboratorio (perfiles de puesto) y mantenerlos actualizados. F) La competencia del personal debe ser evaluada en forma continúa por ejemplo a través de controles de calidad, ensayos intralaboratorios e interlaboratorios, H) La formación a ser adquirida deberá orientarse a garantizar la competencia en las técnicas y métodos realizados por el personal involucrado en el ensayo. Capacitación del personal: El personal deberá contar con conocimientos, experiencia y competencia de acuerdo a la tarea y responsabilidades que tenga asignadas. Todo el personal técnico debe recibir un adecuado entrenamiento que incluyen técnicas básicas de microbiología como ser manipulación en condiciones de esterilidad y adecuado criterio para dicha disciplina. Relación de dependencia LABORATORIO

6 Instalaciones y condiciones ambientales
Equipamiento necesario Limpieza y orden Reglas de acceso y utilización de las áreas Monitoreo ambiental Las instalaciones del laboratorio de ensayo (incluye fuente de energía, luz y condiciones ambientales) deben ser capaces de facilitar la realización correcta de los ensayos. Los requisitos técnicos necesarios para que las instalaciones no afecten los resultados de los ensayos deben estar documentados. Debe haber una efectiva separación entre áreas vecinas en las que se realicen actividades incompatibles. Se deben tomar medidas para prevenir la contaminación cruzada. La ubicación, el diseño y la distribución de las diferentes áreas que integran el laboratorio deben minimizar el riesgo de contaminación de las muestras y los cultivos. En la práctica esto se puede lograr: Separando las actividades en tiempo y espacio. Mediante la construcción del laboratorio según un diseño “sin camino de regreso” se puede obtener una reducción significativa del riesgo de contaminación cruzada. Llevando a cabo los procedimientos de una manera secuencial, usando las precauciones apropiadas para asegurar la integridad de la muestra y del ensayo. Por ejemplo uso de recipientes herméticamente cerrados. El área analítica debe estar separada de la de preparación de medios de cultivo y lavado de material. Es conveniente separar las siguientes áreas: zona de recepción y almacenamiento de muestras. preparación, muestreo y pesada de muestras. área de siembra área de apoyo: donde se realiza la preparación de los medios y reactivos, esterilización, descontaminación, lavado de material. Condiciones Ambientales El laboratorio debe asegurarse que las condiciones ambientales, bajo las cuales se realizan los ensayos microbiológicos, no invaliden los resultados de ensayo ni comprometan la calidad requerida de los resultados. El laboratorio deberá establecer un programa documentado de limpieza y desinfección que tenga en cuenta los resultados de vigilancia de las condiciones ambientales y la posibilidad de contaminación cruzada. Plan de higiene: Son los procedimientos operativos empleados durante la realización del trabajo en el laboratorio. Tiene como principal objetivo evitar la contaminación en todas las etapas del ensayo lo que implicaría obtención de resultados erróneos, la infección del personal, etc. El laboratorio debe monitorear, controlar y registrar las condiciones ambientales LABORATORIO Separación de áreas donde se realizan ensayos incompatibles Plan de higiene

7 Ejemplo de la planta de laboratorio
Sala de lavado Droguero Oficina 2 Sala de preparación de muestras Sala de preparación de material 3 4 5 7 10.2 1 9 Sala de siembra Area de acceso restringido 8 6 10 Véase un ejemplo de planta de laboratorio de microbiología de alimentos. Balanza Campana de flujo laminar o cabina de seguridad Microscopio Estufa de cultivo Heladera con congelador Congelador para mantenimiento de cepas de referencia a -70º Celsius. Estufa de esterilización Autoclave de descontaminación Autoclave de esterilización Estufa de secado

8 MONITOREO AMBIENTAL En el laboratorio de microbiología se debe evaluar: La calidad microbiológica del aire. La calidad microbiológica de las superficies. La calidad microbiológica del aire y las superficies del laboratorio en microbiología es un indicador de la efectividad de las tareas realizadas según el plan de limpieza, desinfección y mantenimiento y plan de higiene. El procedimiento de monitoreo ambiental consta de: una toma de muestra, lugares de toma de muestra, límites de tolerancia o criterios de aceptación o rechazo, frecuencia de monitoreo y acciones correctivas a tomar en caso de desvíos de los límites establecidos. El programa de muestreo para monitoreo ambiental incluye: la determinación cuantitativa de microorganismos presentes en el ambiente (recuento total o recuento de determinados tipos de microorganismos como por ejemplo hongos) y la determinación cualitativa de algunos patógenos y/o indicadores dependiendo de los ensayos que realiza el laboratorio (Ejemplo: Enterobacterias, Coliformes, Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Listeria spp, Staphylococcus aureus). Esto se aplica tanto a control ambiental del área analítica del laboratorio como para las campanas de flujo laminar. La frecuencia con la que se realiza el monitoreo ambiental la debe establecer el laboratorio teniendo en cuenta la frecuencia de uso de las áreas y los resultados previos. Se debe interrumpir los ensayos cuando las condiciones ambientales comprometan los resultados de ensayo.

9 Métodos de ensayo microbiológicos
Existencia y selección de métodos y procedimientos de ensayo apropiados Instrucciones de uso disponible para el personal técnico que realiza el ensayo Actualización Acuerdo con el cliente Selección de Métodos: El análisis microbiológico tiene como fin proporcionar información confiable acerca de la inocuidad y calidad sanitaria de los alimentos. Es por ello que es indispensable la elección de un método de ensayo adecuado. El laboratorio debe utilizar los métodos de ensayo que satisfagan la necesidad del cliente y que sean apropiados para los ensayos que realiza. El laboratorio debe aplicar métodos y procedimientos apropiados para todos los ensayos dentro de su alcance (incluye muestreo, manipulación, transporte, almacenamiento, preparación de las muestras a ensayar, estimación de la incertidumbre y empleo de técnicas estadísticas para el análisis de datos de los ensayos). El laboratorio puede utilizar métodos oficiales, métodos normalizados nacionales e internacionales, o métodos internos desarrollados por él mismo. Es recomendable la utilización de métodos normalizados o de referencia, siempre y cuando éstos estén disponibles y sean apropiados. Instrucciones para realizar el ensayo: El personal que realiza el ensayo debe tener disponibles en el laboratorio las instrucciones para: El uso y el funcionamiento de todo el equipamiento empleado, la manipulación y la preparación de las muestras a ensayar. Tiene que contar con el diagrama de flujo del ensayo propiamente dicho. Todas las instrucciones, Normas, manuales y datos de referencia necesarios para la realización del ensayo deben mantenerse actualizados y estar disponible para el personal técnico. Comunicación con el cliente: El cliente debe ser informado del método elegido. El laboratorio debe informar al cliente si el método propuesto por este último se considera inapropiado o desactualizado. LABORATORIO

10 Medios de cultivo y reactivos
El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea apropiada para los ensayos realizados. El laboratorio debe asegurarse de que la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea apropiada para los ensayos realizados. Los lotes de medios adquiridos comercialmente deben estar debidamente identificados. Cada lote recibido por el laboratorio debe ir acompañado de evidencias del cumplimiento de las especificaciones de calidad. El laboratorio debe asegurarse de que el fabricante notifique cualquier cambio en las especificaciones de calidad. Cada lote de productos suministrado debe incluir una garantía de que cumple la especificación. Preparación de medios de cultivo: La preparación adecuada de medios de cultivo es uno de los pasos fundamentales en el examen del microbiológico y se le dará un especial cuidado.

11 Medios de cultivo Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio a partir de sus diferentes componentes o a partir de productos en polvo deshidratados comerciales, pero también pueden adquirirse medios listos para su uso. Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio a partir de sus diferentes componentes o a partir de productos en polvo deshidratados comerciales, pero también pueden adquirirse medios listos para su uso.

12 Medios de cultivo El laboratorio debe contar con:
Especificaciones de calidad provistas por el fabricante en el momento de la entrega del producto. Procedimientos documentados para la preparación, esterilización y almacenamiento de los medios de cultivo así como su adecuada implementación. Procedimientos documentados para la evaluación de la calidad de los medios de cultivo y su adecuada implementación. Procedimientos documentados para el lavado de material y su adecuada implementación. El laboratorio debe contar con: Especificaciones de calidad provistas por el fabricante en el momento de la entrega del producto. Procedimientos documentados para la preparación, esterilización y almacenamiento de los medios de cultivo así como su adecuada implementación. Procedimientos documentados para la evaluación de la calidad de los medios de cultivo y su adecuada implementación. Procedimientos documentados para el lavado de material y su adecuada implementación.

13 Evaluación de calidad de los medios de cultivo
Se debe evaluar: Productividad: rendimiento, recuperación, crecimiento de un microorganismo que se espera que desarrolle en el medio de cultivo. Selectividad: la supresión del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de cultivo. Se debe evaluar la calidad de los medios de cultivo. Esto implica evaluar su productividad (para medios de cultivo no selectivos y selectivos) y selectividad (para medios de cultivo selectivos). Para lo cual se tomarán como base las normas: -ISO/TS Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines on preparation and production of culture media-Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory. -ISO/TS Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines on preparation and production of culture media- Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media.

14 Validación de los Métodos microbiológicos
Definición: la validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto. la validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto.

15 ¿Qué se valida? Los métodos no normalizados
Los métodos que diseña o desarrolla. Los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto En el caso en que utilice métodos oficiales, métodos normalizados o métodos de organismos nacionales o internacionales reconocidos, o basados en ellos, antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios deberán verificar su capacidad para cumplir de forma satisfactoria todos los requisitos establecidos en dichos métodos. El laboratorio debe validar los siguientes métodos para confirmar que son aptos para el fin previsto. Se validan: Los métodos no normalizados Los métodos que diseña o desarrolla. Los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto En el caso en que utilice métodos oficiales, métodos normalizados o métodos de organismos nacionales o internacionales reconocidos, o basados en ellos, antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios deberán verificar su capacidad para cumplir de forma satisfactoria todos los requisitos establecidos en dichos métodos. En todos los casos un parámetro para la validación de ensayos microbiológicos es la descripción del método de ensayo.

16 Extensión de la validación
La extensión de la validación necesaria dependerá del método y su aplicación. “La validación es siempre un equilibrio entre costos, riesgos y posibilidades técnicas.” Cada laboratorio establecerá los requisitos que debe cumplir el método, con objeto de demostrar que son adecuados para la finalidad establecida. La extensión de la validación necesaria dependerá del método y su aplicación. “La validación es siempre un equilibrio entre costos, riesgos y posibilidades técnicas.” Esto es muy importante en los métodos microbiológicos, ya que los mismos son intrínsecamente diferentes de otras disciplinas como la física o la química, por el sólo hecho de que se trabaja con seres vivos que responden, y no siempre, a reglas menos generales que las que rigen a las otras. Cada laboratorio establecerá los requisitos que debe cumplir el método, con objeto de demostrar que son adecuados para la finalidad establecida.

17 Métodos de ensayo microbiológicos cualitativos
Primero: Descripción del método de ensayo. Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado: Especificidad Exactitud relativa Desviación positiva y Desviación negativa Límite de detección Efecto matricial Repetibilidad y reproducibilidad Son métodos en los que el resultado se expresa en términos de ausencia/presencia. Los procedimientos de confirmación e identificación del microorganismo, deben ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial, repetibilidad y reproducibilidad Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse muy en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados.

18 Métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos
Primero: Descripción del método de ensayo. Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado: Especificidad Sensibilidad Exactitud relativa Desviación positiva y Desviación negativa Límite de cuantificación Repetibilidad y reproducibilidad Para los métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos deben considerarse la especificidad, sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad, reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una variabilidad establecida y, en caso necesario, determinar cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados.

19 Estimación de la Incertidumbre de medición en microbiología
Definición: la incertidumbre de medición es un parámetro asociado al resultado de la medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente asignados al mesurando. Definición: la incertidumbre de medición es un parámetro asociado al resultado de la medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente asignados al mesurando. Un laboratorio de ensayo competente debe estar en condiciones de poder brindar una afirmación sobre la incertidumbre de los resultados de los ensayos realizados. Los laboratorios de ensayo deben tener y deben aplicar procedimientos para estimar la incertidumbre de medición. La Incertidumbre de medición es una indicación cuantitativa de la calidad del resultado, da idea de la confiabilidad del resultado. Los análisis microbiológicos se encuadran en la categoría de los ensayos que no permiten realizar un cálculo riguroso, metrológica y estadísticamente válido de la incertidumbre de medida. En general, puede ser apropiado basar la estimación de la incertidumbre en datos de repetibilidad y reproducibilidad exclusivamente, aunque lo ideal es incluir los bias o sesgos (Ejemplo: los bias detectados como resultado de la participación en ensayos de aptitud).

20 Control de datos Adecuada revisión de los cálculos y de la transmisión de datos. Trazabilidad Procedimientos para proteger los datos Validación de los datos informatizados. Almacenamiento de los datos informatizados. Control de los datos: Los cálculos y la transferencia de los datos deben estar sujetos a las verificaciones pertinentes llevadas a cabo de una manera sistemática. Cuando se utilicen computadoras o equipos automatizados para captar, procesar, registrar, informar, almacenar o recuperar los datos de los ensayos o de las calibraciones, el laboratorio debe asegurar que: El soporte lógico de computadora (software), desarrollado por el usuario, esté documentado con el detalle suficiente y convenientemente validado, de modo que se pueda asegurar que es adecuado para el uso. Se establecen e implementan procedimientos para proteger los datos; tales procedimientos deben incluir, pero no limitarse a, la integridad y la confidencialidad de la entrada o recolección de los datos, su almacenamiento, transmisión y procesamiento. Se hace el mantenimiento de las computadoras y equipos automatizados con el fin de asegurar que funcionan adecuadamente y que se encuentran en las condiciones ambientales y de operación necesarias para preservar la integridad de los datos de ensayo y de calibración

21 Equipos Existencia de los equipos necesarios para la correcta ejecución del ensayo Procedimiento: Identificación de equipos Instrucciones de uso disponible LABORATORIO Programa de calibración, verificación y mantenimiento El laboratorio debe estar provisto de todos los equipos necesarios para la correcta ejecución del ensayo. Cuando el laboratorio utilice equipos que estén fuera de su control permanente debe asegurarse que se cumplan los requisitos de esta norma. Los equipos y su soporte lógico usados en la realización del ensayo y muestreo deben tener la exactitud requerida y cumplir con las especificaciones establecidas para los ensayos o calibraciones. Hay equipos cuya exactitud es clave en el impacto sobre la incertidumbre de los resultados por lo que es imprescindible que cumplan siempre con las especificaciones más relevantes del método. Antes de poner en servicio un equipo (incluido el empleado para el muestreo) se lo debe calibrar o verificar con el fin de asegurar que responde a las exigencias especificadas del laboratorio y está conforme a las especificaciones normalizadas pertinentes. El equipo debe ser verificado o calibrado antes de su uso. Como parte de un sistema de calidad, el laboratorio debe documentar e implementar programas para la limpieza, mantenimiento, calibración y/o verificación y esterilidad de los equipos cuando sea necesario. El laboratorio debe establecer un programa para la calibración y/o verificación de los equipos que tengan una influencia directa en los resultados de los ensayos. La frecuencia de estas calibraciones y/o verificaciones se establecerá en función de la experiencia documentada y se basará en el uso, tipo y resultados previos de las calibraciones de los equipos. Los intervalos entre sucesivas calibraciones y/o verificaciones deben ser más cortos que el período de tiempo durante el cual se observan desviaciones del equipo fuera de los límites aceptables. Procedimiento: Manejo de equipos no conformes registros Una Carpeta para cada equipo con los certificados de calibración e historial del equipo

22 Equipos en Microbiología
Material de uso general: Material de vidrio o plástico (Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.), instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc. Estufas, autoclaves, baños termostáticos, heladeras, congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de filtración, etc. Equipos volumétricos como pipetas, distribuidores automáticos, sembradores en espiral, etc. Instrumentos de medida: termómetros, cronómetros, balanzas, medidor de pH, contadores de colonias, etc. Los equipos habituales de un laboratorio microbiológico pueden clasificarse como siguen: Material de uso general: Material de vidrio o plástico (Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.), instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc. Estufas, autoclaves, baños termostáticos, heladeras, congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de filtración, etc. Equipos volumétricos como pipetas, distribuidores automáticos, sembradores en espiral, etc. Instrumentos de medida: termómetros, cronómetros, balanzas, medidor de pH, contadores de colonias, etc.

23 Equipos Deben estar: Mantenidos correctamente
Inequívocamente identificados Calibrados Rotulados en cuanto a su estado de calibración. El mantenimiento de los equipos esenciales debe realizarse a intervalos especificados. Deben estar disponible las instrucciones actualizadas de uso y mantenimiento del equipo (incluido el manual suministrado por el fabricante) para el uso del personal del laboratorio. Debe estar inequívocamente identificado cada equipo con su soporte lógico utilizado para los ensayos (incluido su estado de calibración). Los equipos bajo el control del laboratorio que requieren una calibración deben ser rotulados y identificados de alguna manera para indicar el estado de calibración, incluida la fecha en la que fueron calibrados por última vez y su fecha de vencimiento o el criterio para la próxima calibración.

24 Trazabilidad En microbiología es necesario demostrar trazabilidad en las calibraciones de equipos y para los cultivos de referencia

25 Trazabilidad Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados proporcionan la trazabilidad esencial en las mediciones y son utilizados para: demostrar la exactitud de los resultados calibrar equipos. controlar la calidad del laboratorio validar métodos. permitir la comparación de métodos. Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados proporcionan la trazabilidad esencial en las mediciones y son utilizados para: demostrar la exactitud de los resultados calibrar equipos. controlar la calidad del laboratorio validar métodos. permitir la comparación de métodos. En microbiología es necesario demostrar trazabilidad en las calibraciones de equipos y para los cultivos de referencia

26 Cultivos de referencia
Las cepas de referencia son necesarias para : La evaluación de la calidad de los medios de cultivo. Validar métodos Realizar controles de calidad interno durante la ejecución de los ensayos Las cepas de referencia son necesarias para evaluar la calidad de los medios de cultivo, para validar métodos y para realizar controles de calidad interno durante la ejecución de los ensayos.

27 Esquema de cultivos de referencia:
CEPA DE REFERENCIA CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS (Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.) Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA CEPAS DE TRABAJO (Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento) UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD * Reconstitución (Sólo se acepta un único repique) Descongelación / reconstitución Se subcultiva una sola vez. Definiciones: Cultivos de referencia: Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y cultivos de trabajo. Cepas de referencia: Se obtienen de una colección de cultivo de referencia reconocido. Son microorganismos definidos por lo menos a nivel de género y especie, catalogados, muy caracterizados y de origen conocido. [ISO :2000] Cepas de reserva: Cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia. [ISO :2000] Cepas de trabajo: subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo precisen. En este proceso es necesario tener trazabilidad. Para demostrar la trazabilidad, las cepas de referencia se obtienen a partir de una colección nacional o internacional reconocida. ( * ) Deben realizarse los controles de pureza y pruebas bioquímicas de la cepa.

28 Muestreo Elección del Plan de muestreo Procedimiento de muestreo
Personal capacitado para realizar el muestreo Documentación: Plan de muestreo usado. Procedimiento empleado Identificación de la muestra Condiciones ambientales Descripción del lugar de muestreo El muestreo es un procedimiento definido por el cual se toma a partir del alimento una muestra representativa del total para su análisis. Frecuentemente los laboratorios de ensayo no realizan el muestreo inicial para obtener los especímenes del ensayo. Para aquellos laboratorios que son responsables del muestreo, es muy recomendable que el mismo esté cubierto por un sistema de aseguramiento de la calidad, y mejor aún por una acreditación. Cuando el laboratorio sea el responsable de realizar el muestreo debe tener un plan y procedimientos. El plan y los procedimientos de muestreo deben estar disponibles en el lugar donde se realiza el muestreo Los planes de muestreo deben ser razonables y estar basados en métodos estadísticos apropiados. El laboratorio debe tener procedimientos para registrar los datos y operaciones relacionados con el muestreo. Estos registros deben incluir: procedimiento de muestreo usado, identificación del muestreador, condiciones ambientales, técnicas estadísticas en las que se basa el procedimiento de muestreo y identificación del lugar del muestreo (puede ser a través de un diagrama). Identificar correctamente la muestra y acompañarla de la documentación requerida El muestreo debe ser realizado únicamente por personal debidamente entrenado y calificado.

29 Diagrama de flujo de manipulación de las muestras
Muestreo Transporte Conformidad de las condiciones de recepción de las muestras Apertura de PE Si No Recepción e identificación de las muestras Acuerdo de procesamiento de las muestras Comunicarse con el cliente Rechazo de la muestra Almacenamiento Realización del ensayo Emisión del informe de ensayo Disposición final de las muestras El laboratorio debe tener procedimientos para el transporte, la recepción, la manipulación, la protección, el almacenamiento, la conservación o la disposición final de las muestras a ensayar. El laboratorio debe tener un sistema para la identificación de las muestras a ensayar. La identificación debe ser conservada a lo largo de la vida de la muestra en el laboratorio. El sistema debe ser diseñado y operado de modo tal que asegure que las muestras no puedan ser confundidas físicamente o cuando se haga referencia a ellas en registros u otros documentos. El laboratorio debe tener procedimientos e instalaciones apropiadas para evitar el deterioro, la pérdida o daño de las muestras durante manipulación, preparación y almacenamiento. Transporte de las muestras: Se debe evitar durante el transporte al laboratorio cualquier alteración de las muestras. Se documentará quién es el responsable del transporte y la conservación de las muestras entre el muestreo y su entrega al laboratorio de ensayo. El tipo de acondicionamiento dependerá del estado físico del producto (líquido, sólido o semisólido). Deberá tomarse en cuenta la naturaleza del producto, y su presentación. El transporte debe realizarse en recipientes adecuados donde se respeten las temperaturas de conservación del alimento. Recepción de las muestras: Las condiciones de llegada al laboratorio de las muestras deben ser verificadas por el personal perteneciente al mismo. Es importante tener en cuenta que la flora microbiana que poseen las muestras a ensayar puede ser sensible a factores tales como temperatura o duración del almacenamiento y transporte, por lo que es importante verificar y registrar el estado de la muestra cuando se recibe en el laboratorio. Se deben registrar los apartamientos de las condiciones especificadas para las muestras en el momento de su recepción en el laboratorio. Si la muestra es insuficiente o se encuentra en mal estado por deterioro físico, temperatura inapropiada, envase roto o etiquetado defectuoso, el laboratorio debe consultar con el cliente antes de decidir si analiza o rechaza la muestra. En cualquier caso, debe indicar su estado en el informe del ensayo. PE: cuando un cliente externo solicita ensayos de muestras que ingresan al laboratorio se abre un pedido de ensayo (PE). N ° PE: numeración única y correlativa de las muestras recepcionadas, asignada por el laboratorio. Almacenamiento de las muestras: Las muestras que se encuentren a la espera de ser analizadas deben almacenarse en condiciones adecuadas para reducir al mínimo cualquier modificación en la población microbiana presente. El laboratorio debe definir y registrar dichas condiciones de conservación. Preparación La preparación de las muestras y porciones de ensayo realizado por el laboratorio inmediatamente antes del ensayo debe efectuarse conforme a procedimientos documentados basados en normas nacionales o internacionales, si es que existen, o a métodos internos validados. Disposición final de las muestras: Debe existir un procedimiento documentado para la conservación y eliminación de muestras. Las muestras deben conservarse hasta que se hayan obtenido los resultados del ensayo, o más tiempo según sea necesario. Cuando se sepa que algunas porciones de muestras de ensayo del laboratorio están altamente contaminadas, deben descontaminarse antes de su eliminación.

30 Aseguramiento de la calidad de los resultados
El laboratorio debe tener procedimientos de control de calidad para monitorear la validez de los ensayos llevados a cabo. Control de calidad interno: El control de calidad interno consiste en todos los procedimientos realizados por un laboratorio para la evaluación continua de su trabajo. Control de calidad externo: Comprende la participación en Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (“Proficiency Testing”) y constituyen un medio independiente por el cual un laboratorio se puede evaluar objetivamente y demostrar la veracidad y precisión de los resultados obtenidos por sus métodos analíticos. Es un programa de actividades llevadas a cabo por el laboratorio con la finalidad de verificar que los resultados obtenidos tienen una precisión y exactitud aceptable y mejorar en conjunto el funcionamiento del mismo. Dicho programa debe abarcar todos los ensayos incluidos en el alcance de acreditación del laboratorio. La frecuencia de realización de cada uno de estos Programas queda establecida por el laboratorio. Controles de calidad Son las actividades que se deben realizar para todos los ensayos acreditados y comprenden: Control de calidad interno: El control de calidad interno consiste en todos los procedimientos realizados por un laboratorio para la evaluación continua de su trabajo. El principal objetivo es asegurar la coherencia de los resultados obtenidos diariamente y el cumplimiento de los criterios establecidos. Comprende: Uso de cepas de referencia durante la realización del ensayo (control positivo, negativo o muestras inoculadas para control) o como control de productividad y selectividad de los medios de cultivos usados. Participación en Ensayos Intralaboratorio: para ensayos cualitativos y cuantitativos. En los ensayos cualitativos se verifica que los resultados entre analistas sean concordantes y conformes. Para ensayos cuantitativo, el laboratorio, en forma periódica, planifica, realiza y verifica que esté bajo control: El análisis por duplicado de una misma muestra por los distintos analistas que realizan el ensayo (determino la repetibilidad de cada analista y la repetibilidad del laboratorio). Los recuentos cruzados entre analistas o con métodos diferentes, etc. (determino la reproducibilidad). Control de calidad externo: Comprende la participación en Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (“Proficiency Testing”) Los programas de ensayos de aptitud organizados externamente por un proveedor de ensayos interlaboratorio constituyen un medio independiente por el cual un laboratorio se puede evaluar objetivamente y demostrar la veracidad y precisión de los resultados obtenidos por sus métodos analíticos. La participación en estos ensayos permite al laboratorio comparar sus resultados frente a los de otros laboratorios. Es importante evaluar los resultados obtenidos en los ensayos de aptitud como una manera de comprobar la calidad de los ensayos, adoptando las medidas oportunas, si son necesarias. Los laboratorios no sólo deben usar la valoración de calidad externa para evaluar el “bias” o sesgo del laboratorio sino también para verificar la validez del sistema de calidad entero. Los resultados de los laboratorios participantes de una ronda interlaboratorio se clasificarán dependiendo del método estadístico usado para evaluar los resultados en: satisfactorios e insatisfactorios (Ejemplo: ensayos cualitativos) o satisfactorios, cuestionables e insatisfactorios (Ejemplo: Z-score). Los laboratorios deben participar regularmente en Ensayos de Aptitud Interlaboratorio que sean pertinente al alcance de la acreditación, se debe dar preferencia a esquemas de Ensayos de Aptitud Interlaboratorio que usen matrices apropiadas. Evaluación de las tendencias de los resultados obtenidos Los gráficos de control son una herramienta de trabajo para el control estadístico de los resultados de ensayo y sirven para monitorearlos.

31 Informe de los resultados de ensayo
Contienen los resultados de los ensayos Contienen la descripción o referencia a la metodología utilizada Deben ser claros, precisos, unívocos, objetivos Pueden transmitirse en forma electrónica, luego de acordar con el cliente y cumplir con la norma Contiene la información que solicitó el cliente Los resultados del ensayo deben ser informados en forma exacta, clara, no ambigua y objetiva, de acuerdo a las instrucciones específicas del método de ensayo. Los resultados se informan en un informe de ensayo. Dicho informe debe incluir toda la información requerida por el cliente, el método utilizado y la información necesaria para la interpretación de los resultados de ensayo. Los informes de ensayo pueden ser entregados al cliente como copia o por transferencia electrónica de los datos. 10.1 Cada informe de ensayo debe incluir la siguiente información: (Ver documento modelo de Informe de ensayo) Título: “Informe de ensayo” Nombre, dirección o lugar donde se realizaron el/los ensayo/s. Una identificación única del informe de ensayo. Dicha identificación debe figurar en todas las páginas para asegurar que todas las páginas sean reconocidas como parte del informe. Los informes deben incluir el número de página y número total páginas. Nombre y dirección del cliente. Descripción o referencia de la metodología utilizada. Descripción e identificación unívoca de las muestras analizadas. Fecha de recepción de las muestras en el laboratorio. Resultados de los ensayos con sus unidades de medida. Firmas, nombre, apellido y función de las personas que autorizan el informe de ensayo. Se recomienda incluir una declaración indicando que no se debe reproducir parcialmente el informe de ensayo sin la aprobación escrita del laboratorio. Cuando sea necesario para la interpretación de los resultados o lo requiera el cliente se debe incluir en el informe: desviaciones respecto de las condiciones de ensayo, una declaración de cumplimiento o no de una especificación o requisito, la incertidumbre de medición estimada, opiniones e interpretaciones de los resultados, información adicional. 10.2 La presentación del Informe de ensayo debe minimizar la posibilidad de mal interpretación o mal uso. Pueden contener opiniones e interpretaciones Contienen las indicaciones mínimas definidas en la norma

32 Muchas gracias Los laboratorios microbiológicos que tengan como objetivo acreditar ensayos según la norma deberán tener, en cuenta en este proceso, los aspectos fundamentales que determinan la confiabilidad y exactitud de los resultados en está disciplina. Será por cierto una experiencia beneficiosa para el laboratorio y también para sus clientes. ¡Éxito! ¡Y muchas gracias!