Hibridación in situ Fundamentos y aplicaciones

Presentación del tema: "Hibridación in situ Fundamentos y aplicaciones"— Transcripción de la presentación:

1 Hibridación in situ Fundamentos y aplicaciones

2 CONCEPTO La hibridación in situ permite visualizar una secuencia de ADN o ARN justo en el sitio físico en el que se encuentra, permitiendo analizar su distribución en cromosomas, células y tejidos. FUNDAMENTO Se basa en la complementariedad de las bases que componen los ácidos nucleicos: G con C (ADN y ARN) y A con T (ADN), o U (ARN). Se diseña una sonda marcada que hibride con la secuencia a detectar.

3 Este sistema permite estudiar la distribución in situ de una determinada secuencia de interés:
Las que revelan la presencia de algún patógeno Asociadas a enfermedades de origen genético Las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores o las que se emplean como indicadores de alteraciones numéricas del conjunto de cromosomas de un individuo

4 Tipos de sondas ADNcd ADNcs ARN Oligonucleótidos sintéticos Marcaje de las sondas - radioactivo: uso de radioisótopos (revelado por ARG) P32 P33 H3 S35 - no radioactivo: marcaje directo e indirecto mediante haptenos (detección inmunológica) Digoxigenina ALP Peroxidasa Biotina FITC

5 Pasos para la hibridación in situ
a) Generación de ácidos nucleicos marcados para una detección subsecuente. b) Fijación de tejidos (seccionados), preparación de cromosomas. c) Preparación del tejido para incrementar el acceso del ácido nucleico marcado. d) Hibridación de la sonda marcada en cromosomas o tejidos. e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan. f) Detección de la sonda marcada, revelando la localización celular de los ácidos nucleicos.

6 Aplicaciones de la hibridación in situ
1) Expresión génica Expresión del gen Nkx2.1, esencial para el desarrollo de los pulmones, la glándula tiroidea y los ganglios basales telencefálicos. 2) Infecciones virales Diagnóstico de HPV Diagnóstico de EBV Diagnóstico de CMV

7 3) Diagnóstico Gen HER2: produce una proteína homónima, cuya alteración puede ocasionar cáncer. Durante el desarrollo del cáncer este gen se amplifica provocando la sobreexpresión de la proteína. La amplificación del gen HER2 se asocia a tumores de mama muy activos y con una tasa de supervivencia muy baja. HER2 no amplificado HER2 amplificado

8 Hibridación in situ fluorescente (FISH)

9 CITOGENÉTICA MOLECULAR
Análisis de reordenamientos cromosómicos complejos y su identificación inequívoca. Identificación de genes particulares sobre el cromosoma Objetivo Detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos en cromosomas, células en interfase y secciones de tejidos morfológicamente preservados Fundamento Característica física del ADN de desnaturalización-renaturalización en respuestas a cambios de temperatura Capacidad de renaturalizarse con una molécula foránea pero homóloga a su secuencia (hibridación) Característica dinámica del ADN que no afecta la morfología cromosómica

10 PROTOCOLO DESNATURALIZACIÓN DE LA SONDA Mezclar con Sn de Hibridación
Calentar a 85ºC DESNATURALIZACIÓN DEL ADN BLANCO Sn de Formamida 70% a 72ºC Deshidratar en alcoholes: % HIBRIDACIÓN Cámara húmeda a 37ºC REVELADO-OBSERVACIÓN

11 SONDAS Fragmentos de ADN ( pb) homólogos a la secuencia blanco, marcados con una molécula detectable directamente o mediante una reacción inmunoquímica Estos fragmentos deben cubrir una región de por lo menos 100 kb para poder ser detectados al microscopio

12 DIRECTAS: La sonda está marcada con un fluorocromo INDIRECTAS: La sonda está marcada con una molécula detectable mediante una reacción antígeno-anticuerpo, donde el anticuerpo está unido al fluorocromo

13 Según la extensión de la región a detectar se dividen en:
Contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrómeros y telómeros de los cromosomas. Colecciones de sondas de un tamaño reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma. Se hibridan a una región particular de un gen. Estas sondas son útiles cuando se ha aislado una pequeña parte de un gen y se quiere averiguar en qué cromosoma se encuentra.

14 Sondas gen-específicas
Ej: Inactivación del cromosoma X en sexo femenino. Centro de inactivación (Xic) ligado al X. Incluye el locus de inactivación XIST (sobreexpresión en X inactivo; represión en el X activo).

15 Sonda de fusión Sonda de separación NORMAL TRANSLOCADO NORMAL
Punto de ruptura Sonda de separación

16 Sondas región-específicas

17 Sondas de pintado cromosómico
Permite detectar alteraciones estructurales o numéricas (metafase). Inconvenientes: No permite detectar inversiones paracentroméricas Baja resolución, lo que impide detectar pequeñas deleciones, translocaciones y duplicaciones.

18 APLICACIONES CLÍNICAS DE FISH
FISH en la detección de leucemias t(9;22)(q34;q11) origina el  cromosoma Filadelfia Leucemia mieloide crónica (95%) + algunos casos de leucemia linfocítica aguda. Gen de fusión BCR / ABL tiene importancia diagnóstica. Región BCR (22q11.2) Región ABL (9q34) t(8;21) : Gen de fusión AML1 / ETO t(8;21)(q22;q22): Leucemias mieloides agudas, especialmente de tipo M2. Indica pronóstico bueno.

19 FISH en interfase mostrando alteraciones numéricas

20 FISH en espermatozoides
Sondas centroméricas para los cromosomas X, Y, y 18. Sondas locus-específicas para los cromosomas 13 y 21. Porcentaje de espermatozoides cromosómicamente alterados permitiendo enumerar la cantidad de cromosomas/espermatozoide. Indicaciones: Oligoastenoteratozoospermia Abortos recurrentes Baja tasa de fecundación y fallo de la implantación.

21 Cariotipo espectral (FISH multicolor)
Se genera un cariotipo en el que cada cromosoma es pintado de un color. La imagen es procesada digitalmente asignando un color distinto a cada cromosoma. Cromosoma normal: color uniforme Cromosoma con rearreglo: varios colores. Detecta translocaciones, grandes deleciones y duplicaciones. Desventaja: no permite detección de duplicaciones y deleciones de pequeños fragmentos.

22 Hibridación Genómica Comparativa (CGH)
Técnica relacionada con FISH Permite analizar el número de cromosomas totales Control positivo: células adultas normales Resultados analizados por un software NORMAL igual cantidad de rojo y verde = amarillo TRISOMIA > rojo (ADN muestra analizada) MONOSOMIA > verde (ADN control)

23 CGH en cáncer ADN tumoral ADN normal

24 pérdida material genético
ganancia material genético pérdida material genético