DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS

Presentación del tema: "DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS"— Transcripción de la presentación:

1 DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS
LUTEINIZACIÓN ESPONTÁNEA DE CÉLULAS DE GRANULOSA DE OVARIO BOVINO: MODELO EXPERIMENTAL IN VITRO. CAROU MC1, MARURI A1, OLEA G2, LOMBARDO DM1. 1Cátedra de Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Buenos Aires. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). 2Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura. Universidad Nacional del Nordeste. INTRODUCCIÓN RESULTADOS La luteinización es un proceso de diferenciación celular esencial para el éxito de la gestación temprana que involucra la teca interna y células de la granulosa, que son inducidas, por el estímulo ovulatorio a convertirse en cuerpo lúteo (CL). Se define luteinización espontánea a la diferenciación de células de granulosa in vitro a células luteales luego de un tiempo de incubación. Este proceso se puede evaluar comparando la producción de P4 inicial y luego de la incubación. Otros trabajos reportaron que la luteinización espontánea de células de granulosa bovinas aumenta con altas densidades de siembra. Por otro lado se ha demostrado que las células de granulosa producen P4 asociada al procesos de apoptosis y que la apoptosis aumenta al aumentar la densidad de siembra. El objetivo del trabajo fue obtener un modelo experimental in vitro adecuado y confiable para estudiar el proceso de luteinización espontánea de células de cultivo primario de granulosa de ovario bovino (CPGB) y distinguir el aumento de P4 debido a la luteinización del provocado por apoptosis. Los cultivos se clasificaron según fueran obtenidos de ovarios de faena con o sin presencia de CL, evaluando la producción de P4, apoptosis y mitosis en función de la densidad de siembra (3125, 6250, y células/ml) y del tiempo de cultivo (4, 6, 8 y 10 días). Se toma como tiempo inicial el día 4. Los resultados mostraron un aumento de la producción de P4 en función del tiempo (a partir del día 4) en cultivos sembrados con 6250 cél/ml o cél/cubreobjetos de 18X18, a los 8 (59%) y 10 (49%; 3,13 ng P4/ml/densidad al día 4) días de cultivo para CPGB sin CL y a los 8 (62%) y 10 (269%; 2,15 ng P4/ml/densidad al día 4) días para CPGB con CL. El aumento en la producción de P4 se presentó conjuntamente con aumento en la apoptosis a partir del día 10 (86% con CL y 92% sin CL) y la disminución en la mitosis a partir del día 8. Densidades de siembra mayores a 6250 cél/ml presentan elevada apoptosis y desprendimiento de células del cubreobjetos impidiendo el correcto análisis a partir del día 8 y un aumento en la producción de P4 al día 6 asociado al proceso de apoptosis. La densidad de siembra más baja, 3125 cél/ml no presenta aumento en la producción de P4 en el tiempo. DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS Cultivo celular: Se trabajó con cultivos primarios de células de granulosa bovina (CPGB), obtenidas por punción de folículos medianos (3-8 mm) a partir de ovarios de faena con o sin cuerpo lúteo (CL) crecidas en DMEM + F12 suplementado con 5% SFB, Glutamina (2 nM), Gentamicina (50 mg/l), y Funguizona, CO2 al 5% y humedad a saturación. Tratamientos: densidad de siembra (3125, 6250, y células/ml) y el tiempo de incubación (4, 6, 8 y 10 días) n=3. Análisis de figuras apoptóticas y densidad de células por campo por tinción con hematoxilina: Las células fueron crecidas sobre cubreobjetos de 18 x 18 mm. Los tratamientos fueron frenados por fijación con metanol absoluto durante 10 minutos y secados al aire. Luego fueron teñidas durante 15 minutos con hematoxilina de Mayer y viradas con agua corriente tibia. Las células se secaron al aire por 1 hora y se montaron en DPX. Se realizó el conteo de imágenes de apoptosis en microscopio de campo claro (60 campos a 1000 X, aproximadamente 500 células por muestra). Las imágenes fueron capturadas utilizando un sistema de captura de imágenes consistente en un microscopio trinocular modelo DMLS de Leica y cámara con sensibilidad a fluorescencia modelo DC-180 de Leica Inc. El sistema se encuentra soportado por el programa IM50 de Leica. Determinación de P4 por RIA: a los 4, 6, 8 y 10 días de cultivo se guarda una alícuota de 1 ml de medio de cultivo a -20°C. Se utilizó el kit comercial DSL4800, Inmunotech SA. Las muestras de medio de cultivos se evaluaron sin diluir. La concentración de P4 se expresó en relación a la densidad de células por campo. Procedimiento: 1. A los tubos recubiertos de anticuerpo se les agregó sucesivamente: 50 μl de estándares, controles o muestras μl de trazador y se mezcló. 2. Se incubó 1 h entre °C con agitación (350 rpm). 3. Se aspiró cuidadosamente el contenido de los tubos. 4. Se les agregó 500 μl de trazador a 2 tubos adicionales para obtener las cuentas totales. 5. Se determinó la radioactividad incorporada (B) y las cuentas totales (T), por 1 min. (cpm). . CONCLUSIONES Por lo tanto, bajo las condiciones planteadas para lograr la luteinización espontánea de células granulosas provenientes de ovarios bovinos con y sin CL, se necesita una densidad de siembra de 6250 cél/ml y 8 días de cultivo. Resultando éste, un modelo in vitro simple para estudiar la capacidad de las células granulosas de modular su capacidad de luteinizarse bajo diferentes estímulos.