Optimización del ensayo de Crossmatch por Citometría de Flujo (Halifax) para agilizar la evaluación del riesgo inmunológico previo al trasplante. Luciana.

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1 Optimización del ensayo de Crossmatch por Citometría de Flujo (Halifax) para agilizar la evaluación del riesgo inmunológico previo al trasplante. Luciana Mas Dra en Bioquímica Lab. Histocompatibilidad. Hospital Privado. Universitario de Córdoba.

2 El Crossmatch contra donante por citometría de flujo (FXCM) es utilizado en combinación con ensayos de fase sólida para determinar la presencia y fuerza de los anticuerpos anti-HLA donante específicos (DSA). Estos anticuerpos FCXM+/CDC- son clínicamente relevantes y si se reconocen antes del trasplante se puede evitar el rechazo mediante la selección de un donante alternativo o por desensibilización del paciente. *La CF es más sensible que la prueba de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). *Permite detección de anticuerpos anti-HLA que se encuentran a niveles bajos. *Mejora la evaluación del riesgo inmunológico antes del trasplante.

3 El protocolo estándar de FCXM de tres colores utilizado actualmente por la mayoría de los laboratorios, se describió hace más de 25 años. Se puede dividir en dos partes: - La primera consiste en el enriquecimiento de linfocitos de los donantes utilizando un gradiente de Ficoll seguida del tratamiento de las células del donante con pronasa para reducir la expresión del receptor Fc y eliminar las células muertas. - La segunda parte consiste en el ensayo de crossmatch y la detección de anticuerpos por citometría de flujo.

4 Protocolo Estándar FCXM
Incubación de 9 x 106 linfocitos del potencial donante con 20 µl de suero control negativo, positivo y suero del potencial receptor: 30 min, seguida de 2 lavados con PBS de 5 min. Incubación con anti-IgG humana marcada con FITC: 30 min seguida de 1 lavado con PBS de 5 min. Incubación con anti-CD3 PE, anti- CD19 APC y anti-CD45 PerCP: 20 min seguida de 1 lavado con PBS de 5 min. Este procesamiento insume 100 minutos al cual hay que agregarle el tiempo requerido para obtener la suspensión celular y manipulación.

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6 Los resultados son expresados como positivo o negativo y en caso de ser positivos se informa el valor numérico que esta basado en: Un cambio en la mediana de la intensidad de fluorescencia del canal (Median Channel Shift, MCS, valores lineales) del suero en estudio con respecto a un control negativo. b) Relación de media de suero del paciente respecto a la media del CN obtenida de gráficos de tipo dot plot, tomándose como punto de corte el valor de 2 para considerar el crossmatch como positivo.

7 FCXM Linfocitos T FCXM Linfocitos B Poblaciones Linfocitarias NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO

8 El protocolo entero requiere tiempo, típicamente de cuatro horas, pudiendo llevar a retrasos significativos en los trasplantes y comprometiendo la calidad de los órganos. El grupo de Robert Liwski, desarrolló y validó dos ensayos de FCXM, denominados protocolos Halifax y Halifaster: Objetivo: desarrollar un procedimiento acelerado de FCXM sin alterar la calidad y la sensibilidad del ensayo estándar. Se validó un protocolo de FCXM optimizado rápido, que tarda minutos en realizarse, manteniendo al mismo tiempo una excelente sensibilidad del ensayo.

9 Protocolos de Citometría de Flujo
Parámetro Protocolo Halifax Halifaster Hospital Privado Plataforma del ensayo Placa 96 pocillos Tubos 12 x 75 mm Vol. de suero 50 µl 30 µl 20 µl Separación de células Ficoll Hypaque Vol. celular 25 µl 15 µl 300 µl Tiempo 1° incubación 20 minutos 30 minutos Lavados (1° set) 3 x 1 min a 500 g 2 x 5 minutos a 500 g Vol. buffer de lavado 200 µl 2000 µl Vol. anticuerpos 100 µl (*) 5 µl de anti-IgG CD45-PerCP; CD19 APC; CD3 PE CD45-PerCP; CD19 APC; CD3 PE Tiempo 2° incubación 10 minutos 5 minutos Lavados (2° set) 2 x 1 min a 500 g Vol. final suspensión 400 µl 500 µl Tiempo total ensayo 35 minutos 120 minutos Tratamiento con pronasa para clivar los receptores Fc 25minutos de incubación de células con pronasa + lavados = 40 minutos

10 Modificaciones de la técnica estándar.
Incremento en el volumen de suero. Finalidad: aumentar la sensibilidad de la técnica, sobretodo para detectar niveles bajos de anticuerpos donante específicos. Aumenta la relación suero/célula. Unificación de los pasos de marcación. Obtención del MISMO resultado marcando primero con anti-IgG y luego anti-CD3, anti-CD19 y anti-CD45 que colocando todos los marcadores en un solo paso.

11 Modificaciones de la técnica estándar.
Plataforma del ensayo. Se largaron múltiples reacciones en paralelo respetando absolutamente todos los parámetros de la técnica estándar. Se compararon los resultados de ambas plataformas en cada una de las reacciones. Análisis de regresión lineal simple mostró un r2 de En general, los análisis de regresión mostraron coeficientes de correlación altos, demostrando una gran fuerza de asociación entre las dos plataformas de trabajo.

12 *Pedido de Crossmatch contra donante por CF
Las pruebas realizadas contemplaron además, la búsqueda de anticuerpos en las mismas muestras mediante la utilización de LABScreen® Single Antigen Beads (One Lambda, California, USA). CASO: *Pedido de Crossmatch contra donante por CF (pre-trasplante donante vivo). *Derivación de un centro de trasplante. *CDC contra donante: negativo (otro laboratorio).

13 Crossmatch contra donante por CF. Técnica: variante Halifax
Control Negativo Linfocitos T Control Negativo Linfocitos B Control Positivo Linfocitos T Control Positivo Linfocitos B Suero paciente (puro) Suero paciente (puro) Suero paciente (1/50) Suero paciente (1/50)

14 MFI HLA R: A*68/ B*62/ DRB1*14/04 HLA D: A*68/ B*62/44 DRB1*14/17

15 < 300 MFI

16 Los resultados obtenidos mediante la técnica Halifax mostraron una mayor sensibilidad en la detección de anticuerpos que se encuentran a niveles bajos, identificados como anticuerpos específicos de donante mediante la realización de XM virtual, comparado con la técnica estándar(*) (*)corrimiento en los valores de MCS de los sueros positivos.

17 La implementación del protocolo Halifax nos permitirá reducir los tiempos de la realización de la prueba de FCXM, agilizando la distribución de órganos en los operativos de trasplante y disminuyendo los tiempos de isquemia fría.