METODOS INMUNOQUÍMICOS UTILIZADOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS

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1 METODOS INMUNOQUÍMICOS UTILIZADOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS

2 INTRODUCCIÓN La detección de un producto específico del agente infeccioso en las muestras clínicas es muy importante porque ese producto no estaría presente en la muestra en ausencia del agente. Describiremos la detección directa e indirecta de los microorganismos por métodos inmunoquímicos

3 El principio básico de cualquier técnica inmunoquímica es el de que un anticuerpo específico se unirá con un antígeno específico para dar un complejo anticuerpo-antígeno exclusivo. Antigenos Sustancias extrañas , habitualmente proteínas de alto peso molecular o HC, que estimulan la producción de otras proteínas en un huésped humano o animal : Anticuerpo. Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una combinación especifica con el antígeno que ha causado su producción en un animal susceptible. Producidos en respuesta a la invasión de moléculas foráneas en el cuerpo.

4 * Los anticuerpos existen como una o mas unidades en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. Los anticuerpos pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, Los anticuerpos se unen a los antígenos y ayudan al huésped eliminar el agente infeccioso .

5 Cada antígeno también se denomina EPITOPO o determinante antigénico
Los antígenos : Pueden formar parte de la estructura física del patógeno Puede ser un producto químico generado y eliminado por el patógeno. Cada antígeno también se denomina EPITOPO o determinante antigénico

6 Detección de antígenos.
Estas técnicas son muy útiles para el diagnóstico: • rápidas (confirmadas por otras) • técnicas de referencia (elevada eficacia) Muy útiles para identificación de virus y clamidias (más rápidas, sencillas, económicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas) Se investiga un único microorganismo en cada prueba (caro y laborioso) • establecer cuidadosa evaluación clínica del paciente • solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayor probabilidad)

7 Anticuerpos policlonales.
Dado que un microorganismo contiene muchos epitopos diferentes que el huésped reconocerá como extraños y dado que el huésped responderá produciendo anticuerpos contra cada antígeno, el suero del huésped contendrá diversos anticuerpos policlonales.

8 Anticuerpos Monoclonales
La posibilidad de crear una línea celular inmortal productora de grandes cantidades de anticuerpo completamente caracterizado y muy específico, conocido como anticuerpo monoclonal. Son producidos por la descendencia de una célula híbrida producto de una fusión de una célula B plasmática productora de anticuerpos y una célula del mieloma maligno (hibridoma)

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10 Principio de los métodos inmunoquímico utilizado protectora de microorganismos
Numerosos métodos inmunológicos se usan para la detección rápida de bacterias hongos parásitos y virus en muestras de pacientes. Y los mismos reactivos pueden usarse a menudo para identificar estos microorganismos desarrollado en cultivo. Las técnicas se clasifican en: pruebas de precipitación pruebas de aglutinación de partículas ensayos de inmunofluorescencia enzimoinmunoensayos.

11 Pruebas de precipitación
El método para detectar antígenos solubles es la inmunodifusión doble de Ouchterlony Inmunodifusión doble En el método de inmunodifusión doble se forman pequeños pocillos cilíndricos en una capa de agar o agarosa. La muestra del paciente que contiene el antígeno se coloca en un pocillo y el anticuerpo dirigido contra el antígeno que se está buscando se coloca en el pocillo adyacente. En un periodo de 18 a 24 horas El antígeno y el anticuerpo se difunde el uno hacia el otro, lo que produce una banda de precipitación visible en el punto en el que se encuentra, conocido como zona de equivalencia. Éste método se utiliza para detectar Exoantígenos producidos por hongos sistémicos con el propósito de confirmar su presencia en el cultivo. Sin embargo la técnica es demasiado lenta para usarla en la detección del antígeno directamente en las muestras de los pacientes.

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13 Contrainmunoelectroforesis
Es una modificación del método de ouchterlony que acelera la migración de un antígeno y un anticuerpo mediante la aplicación de una corriente eléctrica. La mayoría de los antígenos bacterianos tienen carga negativa en un medio ligeramente alcalino en tanto que los anticuerpos son neutros. Ésta característica de los antígenos bacterianos se utiliza en las pruebas de CIE, en las que las soluciones de anticuerpo y el líquido de la muestra a probar se colocan en pequeños pocillos formados en una capa de agarosa sobre una superficie de vidrio.

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15 Aglutinacion de particulas de latex

16 El antígeno presente en una muestra a probar se unen a los sitios de combinación del anticuerpo expuestos sobre la superficie de las partículas de látex y se forman agregados con enlaces cruzados de partículas de látex y antígeno. El tamano de la particula de latex (0,8 um o mas) facilita la visualizacion de la reaccion de aglutinacion, tambien pueden detectar concentraciones de polisacaridos bacterianos de apenas 0,1 ng/Ml.

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18 Coaglutinacion La coaglutinacion usa anticuerpos unidos a una particula para intensificar la visibilidad de la reaccion de aglutinacion entre el antigeno y el anticuerpo. En este caso las particulas son S, aureus muertos y tratados que en sus paredes celulares contienem gran cantidad de una proteina fijadora de anticuerpos, la proteina A.

19 Aglutinacion de latex reforzada con liposomas
En ciertas condiciones controladas las moleculas de fosfolipidos forman vesiculas pequeñas y cerradas. Las moleculas unidas a la superficie de los liposomas actuan como particulas aglutinantes en una reaccion.

20 Ensayos de inmunofluorescencia
Ensayos de inmunofluorescencia son pruebas muy utilizadas en los laboratorios clínicos para detectar antígenos. En estas pruebas los determinantes antígenos presentes en nuestros pacientes se inmovilizan y fijan sobre porta objetos de vidrio con formol, metanol, etanol o acetona. Luego se aplican a la muestra anticuerpos monoclonales o policlonales conjugados (ligados) con colorantes fluorescentes. La principal ventajas de los ensayos de imunofluorescencia es que permiten la evaluación visual de la suficiencia de una muestra, un factor importante cuando se usan pruebas para cuerpos elementales de clamidias o antígenos del virus sincitial respiratorio (RSV). Los miscroscopistas pueden determinar si la muestra fue tomada de las células epiteliales cilíndricas del orificio cervical en el caso de la inmunofluorescencia directa (IFD) para clamidias o de las células basales del epitelio nasal en el caso del (RSV). Sin embargo muchos consideran un problema que la lectura de los preparados sea totalmente subjetiva y que los microbiológicos deban tener un gran entrenamiento para realizar la prueba y para muchos otros requisitos de un microscopio de fluorescencia es un lujo. Las pruebas de inmunofluorescencia se usan habitualmente para detectar virus herpes simple, citomegalovirus, virus varicela zoster, rsv, adenovirus, virus influenza (gripe) y virus parainfluenza en muestras clínicas.

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22 ENZIMOINMUNOENSAYOS Los sistemas de enzimoinmunoensayos (EIA) o de ensayos inmunosorbente llegado a enzimas (ELISA) se desarrollaron originalmente en la década de La prueba básica consiste en unir anticuerpos a enzimas, estas últimas conservan su capacidad de catalizar una reacción que generan un producto final visualmente detectable mientras pertenecen unidas a los anticuerpos. El uso de enzimas como marcadores tiene varias ventajas. La enzima no se altera durante la actividad, puede realizar la reacción de muchas moléculas de sustrato, lo que amplifica en gran cantidad medida la reacción y mejora la detección. Los anticuerpos conjugados con la enzima son estables y pueden almacenarse durante un tiempo relativamente largo. La formación de un producto final coloreado permite la observación directa de la reacción o la lectura espectrofotométrica automatizada.

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24 INMUNOENSAYOS EN FASE SÓLIDA
La mayoría de los sistemas de ELISA desarrollados para detectar agentes infecciosos consisten en un anticuerpo dirigido contra el agente en cuestión, firmemente unido a una matriz sólida, sea el interior de los pocillos de una placa de microdilución o la superficie externa de una perla esférica de plástico o de metal. Éstos sistemas se denominan ensayos inmunosorbentes en fase sólida (SPIA). Si el antígeno está presente en el líquido que se va evaluar, se forman complejos antígeno-anticuerpo estables cuando el líquido se agrega al soporte.

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26 OTROS INMUNOENSAYOS Varios otros métodos entre ellos el radiounmunoensayo (RIA) y el inmunoensayo fluorescente (FIA) son similares al ELISA, con la única diferencia de que los radionúclidos se usan en lugar de las enzimas en el RIA y los fluorocromos sustituyen a las enzimas en el FIA. Aunque el RIA era el principal método de detección de antígeno para numerosos afentes infecciosos, incluido el virus de la hepatitis B, ha sido reemplazado en gran medida por las pruebas de ELISA, que no requieren el uso de sustancias radiactivas.

27 Diagnóstico serológico de las enfermedades infecciosas

28 Serodiagnóstico de las Enfermedades Infecciosas
La mayoría de las enfermedades provocan un espectro de respuestas en los seres humanos infectados. Una persona puede desarrollar anticuerpos por una infección subclínica o después de la colonización por un agente sin haber experimentado síntomas de la enfermedad. En estos casos la presencia de anticuerpos en una sola muestra de suero pueden indicar tan solo el contacto pasado con el agente y no se pueden usar para diagnosticar una enfermedad reciente.

29 Por lo tanto en la inmensa mayoría de los procedimientos serológicos para el diagnostico de una infección reciente el método de elección es la determinación de anticuerpos en suero de la etapa aguda y de la etapa de convalecencia. Salvo para detectar IgM. Por otra parte, según el agente etiológico, hasta los niveles mas bajos de anticuerpos pueden proteger a un paciente de los efectos anatopalógicos de la enfermedad pero no prevenir la reinfección.

30 Principios de los Métodos de las Pruebas Serológicas
Los anticuerpos pueden detectarse de muchas maneras. En algunos casos, los anticuerpos contra un agente pueden detectarse de mas de una forma pero las diferentes pruebas de detección de anticuerpos pueden no estar midiendo el mismo anticuerpo. Además, las diferentes metodologías tienen grados variables de sensibilidad para detectar anticuerpos aun cuando estos estén presentes.

31 Separación de la IgM de la IgG Para realizar pruebas serológicas
La determinación del nivel de IgM es especialmente útil para las enfermedades que puedan tener formas de presentación inespecíficas. La IgG puede atravesar la placenta con facilidad, los recién nacidos poseen títulos de IgG casi idénticos a los de los maternos durante los 2 o 3 meses de vida, hasta que puedan desarrollar sus propios anticuerpos.

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33 Dado que la molecula de IgM no atraviesa la barrera placentaria, toda IgM detectada tendria que ser de origen fetal. Los agentes dificiles de cultivar o aquellos que la mujer haya entrado en contacto durante su vida como el sifilis, toxoplasma, rubeola, citomegalovirus y herpes, se los han agrupado bajo el acronimo STORCH. Estas pruebas pueden pedirse por separado, de acuerdo con la enfermedad clinica del recien nacido.

34 Se han desarrollado varios métodos para medir solo IgM especifica en sueros que también pueden contener IgG especifica. Las inmunoglobulinas pueden separarse una de otra por medios físicos. La centrifugación a través de un gradiente de sacarosa, realizada a velocidades muy altas, se usaba en el pasado para separar IgG de la IgM, que tiene un peso molecular mayor.

35 Otros sistemas de separación de la IgM se basan en que ciertas proteínas de la superficie de los estafilococos( proteina A) y de los estreptococos (proteina G) se unen a la porción Fc de la IgG. Otros métodos usan anticuerpos para eliminar la IgM de sueros que contienen IgG e IgM .

36 Métodos para la detección de anticuerpos

37 Pruebas de aglutinación directa de patógenos enteros
Las pruebas más básicas para detección de anticuerpos son los que miden los anticuerpos producidos por un huésped contra determinantes presentes en la superficie de un agente bacteriano en respuesta a la infección por ese agente. Los anticuerpos específicos se unen a los antígenos de superficie de la bacterias en una suspensión densa y determinan que las bacterias se aglutinen en agregados visibles.

38 Estos anticuerpos se denominan aglutininas y la prueba se denomina aglutinación bacteriana.
La realización de las pruebas de aglutinación en solución fisiológica estéril(cloruro de sodio al 0,85% en agua destilada), que contiene iones positivos libres, aumentan la capacidad de los anticuerpos de causar agregación de las bacterias. Pueden realizarse tanto sobre porta objetos de vidrio como en tubos de ensayo.

39 Las pruebas de aglutinación bacteriana se utilizan con frecuencia para el diagnóstico de enfermedades en las que el agente bacteriano es difícil de cultivar in vitro. Figuran el tétanos, la yersiniosis, la leptospirosis, la brucelosis y la tularemia.

40 Pruebas de aglutinación de partículas
Se han desarrollado numerosos procedimientos serológicos para detectar anticuerpos mediante la aglutinación de una partícula portadora artificial con el antígeno unidos a su superficie. Los portadores artificiales, como las partículas de látex o los eritrocitos tratados o los portadores biológicos, como las células bacterianas enteras, pueden transportar un antígeno en su superficie, que se unirá con el anticuerpo producido en respuesta a ese antígeno cuando sea introducido en el huésped.

41 Los resultados de las pruebas de aglutinación de partículas dependen de varios factores, incluidos la cantidad y la avidez del antígeno conjugado por el portador, el tiempo de incubación con el suero de el paciente y el microclima de la interacción(pH y proteínas). En el mercado existen sistemas complejos para el uso de pruebas de aglutinación de partículas de látex u otras partículas para detección exacta y sensible de anticuerpos contra citomegalovirus, virus de la rubeóla, virus varicela zoster, anticuerpos heterófilos de la mononucleósis infecciosa, anticuerpos contra el ácido teicoico de estafilococos, y otros.

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43 Pruebas de precipitación
La interacción de un antígeno soluble con su anticuerpo puede producir la formación de un precipitado que es una concentración de partículas finas, por lo general visible sólo porque el producto precipitado es forzado a permanecer en un espacio definido dentro de una matriz. En las pruebas de precipitación el producto final de la precipitación forman grumos macroscópicos y microscópicos.

44 Contrainmunoelectroforesis
Esta prueba se basa en la carga eléctrica neta de los antígenos y los anticuerpos que se estudian en un buffer de prueba determinado. Como el antígeno y los anticuerpos que se buscan migran uno hacia otro en una matriz semisólida bajo la influencia de una corriente eléctrica, el método se conoce como contrainmunoelectroforesis(CIE)

45 Pruebas de inmunodifusión
La prueba de inmunodifusión doble de Ouchterlony, es usada paradetectar anticuerpos dirigidos contra componentes de las células micóticas. Se colocan extractos de celulas enteras u otros antígenos del hongo sospechoso en pocillos de una placa de agarosa y el suero del paciente y un suero control positivo se colocan en pocillos vecinos.

46 Si el paciente ha producido anticuerpos específicos contra el hongo, las líneas de precipitación se visualizaran dentro de la agarosa entre los pocillos con el antígeno homólogo y con el anticuerpo , su identidad con la líneas similares del suero control confirmará los resultados La prueba requiere al menos 48 horas, pero es posible más tiempo para la formación de las bandas.

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49 Prueba de inhibición de la hemaglutinación
Muchos virus humanos pueden unirse a estructuras de la superficie de los eritrocitos de diferentes especies. Por ejemplo, las partículas de virus de la rubeola pueden unirse a eritrocitos humanos del grupo 0, de ganso o de pollo y producir aglutinaciones. Las pruebas serológicas para detectar la presencia de anticuerpos contra estos virus se valen de la propiedades aglutinantes de las partículas virales.

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51 Pruebas de Neutralización.
Los anticuerpos que inhiben la inefectividad de un virus por el bloqueo de su receptor en las células del huésped se denominan anticuerpos neutralizantes. Para la correcta evaluación se mezcla con una suspensión de partículas virales infecciosas del mismo tipo que las que se sospecha que ha infectado al paciente, ésta suspensión control de virus se mezcla con suero normal, seguidamente las células de control mostrarán infección viral.

52 En el caso de que el suero del paciente contenga anticuerpos contra el virus los anticuerpos se unirán a las partículas virales y les impedirán invadir las células del cultivo, entonces nos encontramos con que los anticuerpos han neutralizado la inefectividad del virus, las mismas evaluaciones requieren una idónea habilidad técnica en el manejo de las tecnologías laboratoriales y solo se realizan en laboratorios de referencia

53 Pruebas de Neutralización.
Los anticuerpos que inhiben la inefectividad de un virus por el bloqueo de su receptor en las células del huésped se denominan anticuerpos neutralizantes. Para la correcta evaluación se mezcla con una suspensión de partículas virales infecciosas del mismo tipo que las que se sospecha que ha infectado al paciente, ésta suspensión control de virus se mezcla con suero normal, seguidamente las células de control mostrarán infección viral.

54 En el caso de que el suero del paciente contenga anticuerpos contra el virus los anticuerpos se unirán a las partículas virales y les impedirán invadir las células del cultivo, entonces nos encontramos con que los anticuerpos han neutralizado la inefectividad del virus, las mismas evaluaciones requieren una idónea habilidad técnica en el manejo de las tecnologías laboratoriales y solo se realizan en laboratorios de referencia

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56 Prueba de fijación del complemento
Uno de los métodos clásicos para la demostración de la existencia de anticuerpos en el suero de un paciente es la prueba de fijación del complemento, ésta prueba consta de dos sistemas separados, el primero consiste en el antígeno que se sospecha que causa la enfermedad y el suero del paciente, este es llamado el sistema de prueba, el segundo consiste en una combinación de eritrocitos de carnero, anticuerpos (IgG), fijadores del complemento producidos contra los eritrocitos de carnero animal y una fuente exógena de complemento (por lo general suero de cobayo),

57 la mezcla de estos componentes en concentraciones óptimas los anticuerpos antieritrocitos del carnero se unen a la superficie de los eritrocitos y el complemento se unirá después al complejo antígeno-anticuerpo. El resultado de esta prueba de combinaciones tiene como producto la producción de lisis (destrucción) de los eritrocitos, por esta razón el anticuerpo de carnero también se la denomina hemolisina.

58 El resultado positivo significa que el paciente posee anticuerpos fijadores del complemento y se manifiesta por la ausencia de lisis de los eritrocitos en el sistema de prueba final. La lisis de las células del indicador resulta en una ausencia de anticuerpos y una prueba de fijación del complemento negativa. Esta operación requieren múltiples manipulaciones como por lo menos cuarenta y ocho horas para completar ambos pasos y a menudo los resultados son inespecíficos. Existen nuevos sistemas que permiten una mejor recuperación del patógeno o sus productos y algunos procedimientos más sensibles y menos laboriosos para la detección de anticuerpos, como la aglutinación de partículas, la prueba de inmunofluodescencia indirecta y los procedimientos de ELISA.

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60 Ensayo inmunosorbente ligado a enzimas
Llamado también ELISA, se emplea para detectar anticuerpos contra agentes infecciosos, es sensible y específica. La presencia de anticuerpos específicos se detecta por la capacidad de un segundo anticuerpo, conjugado con un marcador fluorescente o coloreado, de unirse al anticuerpo a determinar que se encuentra unido a su antígeno homólogo. Ventajas: una de ellas es que puede realizarse fácilmente, lo que permite analizar muchas muestras de suero en forma simultánea y que los productos finales, coloreados o fluorescentes, se detectan con facilidad con los instrumentos, lo que elimina el elemento de subjetividad común a tantos procedimientos serológicos que se basan en la interpretación de una reacción por parte de un técnico. Desventajas: éstas incluyen la necesidad de contar con un equipo especial, los tiempos de reacción son bastantes prolongados (horas).

61 Pruebas de inmuno-fluorecencia indirecta y otros métodos inmuno-microscópicos
Para la realización de esta prueba se requiere que se adhiera el antígeno contra el que el paciente ha formado anticuerpos, a la superficie de un porta-objetos, seguidamente el suero del paciente se diluye y se coloca en el porta- objetos cubriendo el área en la que se encuentra el antígeno. Si existieren anticuerpos en el suero se unirán éstas a su antígeno específico. El anticuerpo que no se haya unificado se eliminará mediante un adecuado lavado del porta-objetos.

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63 Radioinmunoensayos El radioinmunoanálisis RIA es un método para detectar anticuerpos en un laboratorio de química. Se usaron en un comienzo para detectar anticuerpos contra los antígenos del virus de la hepatitis B. El anticuerpo marcado con un radioisótopo compite con el anticuerpo no marcado del paciente por los sitios de unión presentes en una cantidad conocida de antígeno.

64 Una reducción de la radioactividad del complejo antígeno anticuerpo del paciente comparada con las cuentas de radioactividad medidas de una prueba control sin anticuerpos permite cuantificar la cantidad de anticuerpos del paciente unido al antígeno. Logra el desarrollo de nuevas sustancias marcadoras como los sistemas ELISA. La quimioluminiscencia y la fluorescencia han producido pruebas diagnósticas tan sensibles como el RIA, sin los riesgos y problemas de eliminación de material asociado con reactivos radioactivas.

65 Inmunoensayos fluorescentes
Se desarrolló debido a los inconvenientes asociados con el RIA. En estas pruebas se usan colorantes o moléculas fluorescentes como marcadores en lugar de marcadores radiactivos, se basan en el mismo principio que el RIA la diferencia sería que en los sistemas del RIA el anticuerpo competitivo se marca con un radioisótopo y en este se marca el antígeno con compuesto fluorescente bajo los rayos de luz.

66 La unión de los anticuerpos con el antígeno fluorescente puede reducir o eliminar la fluorescencia, puede causar fluorescencia al producir cambios de consumación en una molécula fluorescente. La medición de la fluorescencia es por ende una medida directa de la unión antígeno anticuerpo que no depende de un segundo marcador como en las pruebas de ELISA. Existen sistemas para medir anticuerpos contra numerosos agentes infecciosos así como contra anticuerpos autoinmunitarios.

67 Inmunotransferencia Western Blot
Este método se basa en la separación electroforética de las principales proteínas de un agente infeccioso en una matriz de agarosa bidimensional. Una suspensión de microorganismo contrario que se están buscando los anticuerpos se lisa por procedimiento mecánicos o químicos y la suspensión del antígeno disuelto se siembra en un extremo de un gel poliacrilamida.

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