Obtención, Caracterización y Evaluación de cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae Boris L. Rodríguez González, Ph. D. Departamento de Genética,

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1 Obtención, Caracterización y Evaluación de cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae
Boris L. Rodríguez González, Ph. D. Departamento de Genética, CNIC.

2 El cólera 1. Vía entrada 2. Vence inm. natural 3. Coloniza
4. Enfermedad diarrea + vómitos acidosis dolores musculares choque hipovolémico El cólera 3. Coloniza (produce enterotoxina) 1. Vía entrada 5. Excreción ( 1 L/día) 2. Vence inm. natural

3 Racionalidad vacunas vivas de cólera
1. Vacuna contra el cólera El Tor inexistente. 2. Protección en convalecientes  3 años. 3. Toxina colérica requisito para el cólera gravis. 4. Inmunidad antibacteriana protectora. 5. Inmunidad antitoxina superflua. 6. Desconocimiento de la combinación de Ag Protectores. 7. Vacunas muertas: EP = 60% (exc niños), dosis.

4 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 1
Deleción del profago CTXΦ Cepas patógenas de V. cholerae Estrategia E.coli SM10pir (donante 1) Genes de CTXΦ Conjugación Pases y Selección V cholerae C7258 El Tor Ogawa V cholerae C6706 El Tor Inaba

5 Remoción de CTX . Eventos moleculares
P C1 C2 S1 C6706 C7258 C671 C673 C723 C678 C674 C728 413 417 81 82 84 87 88 LBPA: C67 (1...10) C72 (1...10) Kb  A B C D E 10 pases en LB 23,1 9,4 6,5 4,3 1000 colonias Amp sensibles= 70 LBP y LBPA 2,3 No. 2 No. 1 SONDAS

6 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 2
Inserción del gen celA en el gen de la hemaglutinina proteasa Cepas de generación 1 de V. cholerae Estrategia E.coli SM10pir (donante 2) Conjugación Pases y Selección Hemaglutinina proteasa cel A Cepas de Generación 1 81 y 413

7 Obtención de CGM de V. cholerae por reemplazamiento hap por hap::celA
S1 81 413 61,4,9,10 63 631 638 1332 1333 LBPA: (1...10) 13 (1...10) Kb  A B D E 1000 colonias LBP y LBPA 10 pases en LB 23,1 9,4 6,5 4,3 2,3 Amp sensibles= 21 SONDAS No. 3 No. 4

8 Niveles de toxina colérica en las cepas progenitoras y modificadas

9 Detección de la hemaglutinina proteasa (Hap) en las cepas progenitoras y genéticamente modificadas
Ensayo de ‘Western blot’ Carriles 1: C7258 2: 81 3: 631 4: 638 5:C6706 6:413 7:1333 La detección de Hap fue realizada con una preparación de anticuerpo policlonal anti-Hap odtenido en conejo. (Anticuerpo donado por el Dr. Richard Finkelstein)

10 Detección de la actividad celulolítica de las cepas vacunales de V
Detección de la actividad celulolítica de las cepas vacunales de V. cholerae de generación 1 y 2 C A: Western blot con anticuerpos policlonales anti Cel A obtenidos en conejo: Carriles: 1(413); 2 (1333), 3 (81); 4 (631; 5 (638) B: Actividad celulolítica de las cepas vacunales en geles de poliacrilamida (geles de Beguin) C: Actividad celulolítica de la cepa 638 en placa petri

11 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA DETERMINAR LA DOSIS DE TRABAJO CON LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2
9 grupos de ratones balb/c lactantes fueron inoculados con las cepas de V. cholerae que se indican y a las dosis señaladas Cepa C6706 Cepa C7258 103 104 105 N = 12 N = 81 N = 90 N = 39 N =113 Inóculo Vehículo N = 39 Controles Se determinó la sobrevivencia de los animales en los grupos y se compararon entre si. Se empleó el método de log Rank

12 Selección de la dosis de trabajo
Conclusión La dosis 105 UFC de C6706 o C7258: 100 x dosis letal 100%

13 Se determina la sobrevivencia
DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EVALUAR LA VIRULENCIA Y LA CAPACIDAD DE COLONIZACIÓN DE LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2 Cepa 413 Cepa 1333 Cepa 81 Cepa 631 N = 75/grupo Cepa 638 GRUPOS Diseño Se inoculan los ratones Balb/c lactántes con la dósis de trabajo (105 UFC) Se divide cada grupo en dos subgrupos Subgrupo 1: Se determina la sobrevivencia Subgrupo 2: Se determina la capacidad de colonización del intestino delgado UFC/cm2

14 Virulencia y colonización de las CGM (Dosis 105)
-Panel superior: Virulencia. Gráfico de Kaplan-Meier -Panel inferior: Colonización en intestino delgado

15 Efecto de dos formulaciones sobre la viabilidad de dos cepas liofilizadas
Log UFC/mL1-Log UFC/mL2 F13 F94 638 0.76 0.64 CVD103-HGR 0.86 0.71 1 Log UFC/mL antes del proceso de liofilización. 2 Log UFC/mL después del proceso de liofilización. 3 Formulación compuesta por: lactosa, peptona bacteriológica y sorbitol. 4 Formulación compuesta por: leche descremada, peptona bacteriológica y sorbitol.

16 PERDIDA DE VIABILIDAD DE LA CEPA 638 EN DOS FORMULACIONES Y EN DIFERENTES TIEMPOS

17 Anticuerpos Monoclonales y Métodos de Detección
AcM Isotipo Especificidad Utilidad 1G10G5 IgG2a CT-A, reacciona con CT-1 (toxina de V. cholerae O1, clásica) y CT-2 (toxina de V. cholerae O1, El Tor). GM-1 ELISA Western Blot 4D1G5 CT-B, REACCIONA CON CT-1 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, CLÁSICA) Y CT-2 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, EL TOR). GM-1 ELISA Western Blot 2F12F1 IgG3 MSHA de cepas de V. cholerae O1 y O139. ELISA Wester Blot 10E10E1 TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (BIOTIPOS CLÁSICO Y EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. 4D6F9 IgG1 TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (SOLAMENTE BIOTIPO EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. 6G1E12F1 LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139. ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida 4D2G5 IGg2b LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 ELISA, Wester, y Vibriocida 2B4 LPS de cepas de V. cholerae O1 (solamente serotipo Ogawa), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 9A11D6 LPS de cepas de V. cholerae O139, no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O1

18 PATENTE CONCEDIDA

19 PATENTE CONCEDIDA

20 FIN