Influencia de la proteína de choque térmico 90 en la expresión de mediadores y dianas pro-fibróticas del factor de crecimiento transformante beta en.

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1 Influencia de la proteína de choque térmico 90 en la expresión de mediadores y dianas pro-fibróticas del factor de crecimiento transformante beta en el corazón sometido a sobrecarga de presión Raquel García1, Jenny Gómez2, Mª Amor Hurlé Gonzalez1, J. Francisco Nistal Herrera3 y Ana V Villar Ramos1 1Universidad de Cantabria, Santander (Cantabria), 2IDIVAL, Santander (Cantabria) y 3Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Santander (Cantabria) lAntecedentes: La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es diana farmacológica por su papel de estabilizador proteico en cascadas de señalización celular activadas por ligandos como el factor de crecimiento transformante beta (TGFβ). Por ser TGFβ un potente mediador celular del remodelado (hipertrofia y fibrosis) del corazón sometido a sobrecarga de presión, estudiaremos la influencia de Hsp90 en el proceso de la fibrosis miocárdica. Objetivos: - Analizar la expresión génica y proteica de Hsp90 en el corazón de ratón sometido a cirugía de constricción del arco aórtico (CAT) durante dos semanas. Definir las similitudes en el patrón de expresión génica temprana de Hsp90 y factores implicados en la cascada de señalización de TGFβ en el remodelado miocárdico tras la cirugía CAT. - Comprobar la influencia de la inhibición específica de Hsp90 en la expresión de moléculas pro-fibróticas como colágeno I (COL I) en fibroblastos. Métodos: Modelo experimental murino de hipertrofia ventricular izquierda sacrificado a 1, 3, 7, o 14 horas tras CAT. Se analizan las primeras reacciones cardiacas frente a CAT sin factores de confusión por mecanismos compensatorios presentes a largo plazo. Transfección de fibroblastos cardiacos primarios y línea estable de fibroblastos NIH-3T3. QPCR y ELISA con muestras de fibroblastos, ventrículo izquierdo y plasma de ratón sometido a CAT y sham, a tiempo cortos (1, 3, 7, y 14 horas n=5 ratones por grupo) y 2 semanas CAT y sham (n=5 ratones por grupo). Figura 1. Hipótesis de trabajo: Hsp90 como estabilizador de los receptores de TGFβ en el proceso de fibrosis miocárdica (parte superior derecha del fibroblasto). La inhibición química de Hsp90 con 17AAG (parte inferior del fibroblasto en azul) Inhibición de Hsp90 reduciría la acumulación de fibras de colágeno al disminuir la efectividad de la cascada de señalización de TGFβ. Time after TAC→ 1 hour 3 hours 7 hours 14 hours Mouse→ Gene↓   Sham TAC Hsp90aa1 0,03±0,004 0,01±0,002 0,05±0,002* 0,02±0,004 0,02±0,002 0,03+0,002* Hsp90ab1 3,67±1,49 3,38±0,68 3,13±1,63 3,78±0,61* 2,59±0,19 2,20±0,52 2,82±0,16 2,49±0,55 TGFβ 6,4±0,2 6,6±0,3 5,2±0,8 11,2±1,3* 5,7±0,7 5,5±0,4 6,3±0,3 9,3±1,1* TGFβRI 0,05±0,02 0,08±0,01 0,03±0,003 0,06±0,007* 0,04±0,005 0,04±0,004 0,08±0,01* BAMBI 0,11±0,08 0,13±0,02 0,08±0,02 0,13±0,01* 0,09±0,01 0,12±0,01* COL I 4,0±0,3 4,1±0,6 3,0±0,4 7,7±1,3* 4,4±0,5 4,3±0,6 3,9±0,9 6,9±0,8* miR-21 2,7±0,7 22,6±6,4* 2,0±0,1 12,5±3,6* 3,5±1,6 4,4±1,5 6,8±0,1 12,8±1,6* plasma (ng/ml) 0,07±0,01 0,2±0,03* 0,1±0,01 0,1±0,02 0,05±0,01 2,9±0,6 0,9±0,5* 2,1±0,6 1,9±0,7 0,8±0,5 2,2±0,9* 2,3±1,4 2,2±0,7 Figura 1. Ratones con CAT durante 2 semanas A.- Sobreexpresión del RNAm de la isoforma Hsp90aa1 expresada en situaciónes de estrés, en el VI de ratones CAT comparada con sus Sham (**p<0,001, Mann-Whitney test). B.- Sobreexpresión protéica de Hsp90ab1 isoforma constitutiva, en el VI de ratones CAT comparados con sus sham. C.- Cuantificación y WB que muestran la sobreexpresión proteica de Hsp90 en el VI del ratón con CAT frente al Sham. (**p<0,001, Mann-Whitney test). Figura 2. Inhibición de la expresión de colágeno I (COL I) en fibroblastos en cultivo. Expresión relativa de COL I en presencia de TGF-β (0,3 ng/ml) e inhibidor de TGFBR1 (SB ) o inhibidor de Hsp90 (17AAG) en fibroblastos primarios de corazón de ratón respectivamente. A, B.- Disminución de la expression de RNAm de COL I frente al control+TGFβ. C, D.- Disminución la expression del promotor de COL I frente al control+TGFβ en unidades arbitraries de luminiscencia. E, F.- Similitud en el número de células vivas por ensayo en todos los casos descritos tanto en NIH-3T3 como en fibroblastos primarios. (***p<0,001 , **p<0,005, *p<0,01 Mann-Whitney test). test). Tabla 1. Variaciones la expresión génica de Hsp90aa1, Hsp90ab1, TGFβ, TGFBRI, BAMBI, COL I y expresión de miR-21 en ratones a 1, 3, 7 y 14 horas tras CAT. Se observa aumentos significativos a 3 y 14 horas tras CAT. Aumento de la expresión proteica de TGFβ y Hsp90 circulantes con aumentos significativos a las 3 y 14 horas. *p<0,05 vs sham de cada grupo (test t de Student). Resultados: Los niveles de expresión de Hsp90aa1 aumentan de forma paralela y significativa con TGFβ (p<0,05*), su receptor tipo I TGFBRI (p<0,05*) y su pseudo receptor BAMBI (p<0,05*) y COL I (p<0,05*) .El microRNA directamente relacionado con TGFβ miR-21 aumenta además en la primera hora tras CAT (p<0,05*) (Tabla 1). Se observa una mayor presencia de las proteínas TGFβ y Hsp90aa1 plasmáticas previa a ambas explosiones génicas (1 y 7 horas tras CAT). La figura 1 muestra la sobreexpresión de Hsp90aa1 en ratones con CAT durante 2 semanas a nivel genético y proteico. La figura 2 muestra en fibroblastos el aumento del COL I mediado por TGFβ (0,3ng/ml), y su disminución por inhibición específica de la proteína Hsp90 (17AAG, 1 uM), en igual o mayor proporción que la inhibición producida al al inhibir la actividad de sus receptores (SB431542, 10 uM). Conclusiones: Hsp90 coopera en el proceso de síntesis de colágeno mediada por TGFβ en los fibroblastos cardiacos del corazón de ratón sometido a sobrecarga de presión secundaria a la constricción del arco aórtico y podría perfilarse como una diana para la reducción de la fibrosis cardiaca.