Material y Métodos Modelo de proliferación endotelial:

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1 Material y Métodos Modelo de proliferación endotelial: Se utilizaron células endoteliales aisladas a partir de la vena del cordón umbilical (HUVEC) de donantes sanos y fueron tipadas para HLA-A y B. Posteriormente, 1x105 células/pocillo marcadas con CFSE a 4 μM (Invitrogen, Paisley,UK), fueron incubadas y estimuladas con 20 µg/ml o 5 µg/ml de suplemento de crecimiento endotelial (ECGS; BD, San José,CA) en 2 ml de medio completo F12 K RLAM durante 3 días. Efecto de los anticuerpos anti-HLA en HUVEC: HUVEC estimuladas de 12 donantes sanos se incubaron con un pool de sueros de pacientes hiperinmunizados. Posteriormente, en los cultivos estimulados con 20 µg/ml (n=11) y 5 µg/ml (n=12) de ECGS se determinó la proliferación celular, y además en éste último se evaluó la expresión de P-Selectina (n=8).Los niveles de anticuerpos anti-HLA se cuantificaron mediante Luminex Single Antigen (One Lambda, Canoga, CA). La proliferación celular y la expresión de P-Selectina fue valorada mediante el marcaje con CFSE y el anticuerpo monoclonal anti-CD62P (clone AK-4, BD), ambas técnicas evaluadas mediante citometría de flujo (FACSCanto II,BD). Objetivos Determinar las modificaciones in vitro de los anticuerpos anti-HLA presentes en sueros de pacientes hiperinmunizados, sobre proliferación y expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales activadas. Definir los niveles de anticuerpos anti-HLA detectados por Luminex, necesarios para producir dichos efectos biológicos posiblemente implicados en el rechazo del injerto. Introducción Durante décadas se ha estudiado el impacto de los anticuerpos anti-HLA en el trasplante de órgano sólido, quedando demostrado su importante papel en la patogénesis del rechazo mediado por anticuerpos (AMR). Además, existen estudios in vitro que han demostrado los efectos de anticuerpos anti-HLA murinos (W6/32) o alo-anticuerpos purificados a partir de suero humano sobre células endoteliales y musculares. Estos trabajos, afirman que los anticuerpos anti-HLA pueden estimular las células endoteliales, provocando un aumento en la proliferación celular, un incremento en la expresión de moléculas de adhesión celular (P-Selectina, V-CAM, I-CAM) y producción de quimiocinas (1,2). Estos efectos biológicos provocan una inflamación microvascular y promueven el reclutamiento e infiltración de células de la inmunidad innata en el injerto, siendo ambas situaciones características del AMR en el trasplante de órgano sólido. Dado que no se ha documentado la correlación de estos efectos biológicos con los niveles detectados de anticuerpos anti-HLA en suero de pacientes, sería interesante definir un nivel de anticuerpos anti-HLA, cuantificados por Luminex, necesarios para producir dichos efectos biológicos sobre células endoteliales. Conclusiones Sueros de pacientes con anticuerpos anti-HLA inhiben in vitro la proliferación endotelial e incrementan la expresión de moléculas de adhesión celular. Es necesario un nivel mínimo de anticuerpos anti-HLA de aproximadamente MFI para producir dicho efecto. Estos datos, añaden información para entender mejor la respuesta inflamatoria involucrada en el AMR en trasplante de órgano sólido. 1. Valenzuela, N. M. et al, American Journal of Transplantation 13 (2): ; Naemi, Fatmah M. A. et al, Transplantation 96 (3): High levels of Luminex detected anti-HLA antibodies are necessary to induce biological effects on HUVEC J.J. Mata, J.A. Delgado, C. Pérez, L. Moreno, P. Arana, J. Merino, C. Moreno, A. Sánchez Ibarrola Servicio de Inmunología. Clínica Universidad de Navarra. Pamplona. Sueros con anticuerpos anti-HLA incrementan la expresión de P-Selectina en células endoteliales. N=8; * P < 0,05; ** no significativo Célula / Pase A mayor nivel de anticuerpos anti-HLA mayor es el efecto de inhibición. P<0,05 Sensib. 78% ; Especf. 66% VPP 84% ; VPN 57% ** * N=20 r = 0.71 p <0.01 23098 2000 PUNTO CORTE TEÓRICO Y= (MFI Luminex) Sueros con anticuerpos anti-HLA inhiben la proliferación endotelial inducida por ECGS. Resultados C11P1 C3P4 ECGS = 5 µg/ml ECGS = 20 µg/ml N=11 N=12 N=12 Células estimuladas con 20 µg/ml ECGS LSA No inhibición Inhibición MFI <23098 4 3 MFI>23098 2 11 N=12; * P < 0,01; ** no significativo * * ND ** ND