IMPRONTA GENOMICA (“IMPRINTING”)

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1 IMPRONTA GENOMICA (“IMPRINTING”)
Conocimientos requeridos: clases previas de Cromatina y Epigenética Definición: “marca” epigenética que determina la expresión de 1 solo alelo de un cierto locus dependiendo del sexo del progenitor que transmitió ese alelo (parent of origin) ocurre en mamíferos y en plantas Una determinada marca (ya sea de activación o de inactivación) existe en un alelo pero no el otro en células somáticas. Dichas marcas se borran y establecen de novo en la línea germinal, pero de manera diferente en la masculina y femenina

2 concepto relativamente moderno
Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto biológico (de comportamiento): Klopfer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1964) 52: 911–914. Maternal “Imprinting” In Goats Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto genético bien definido: Rastan et al. Nature (1983) 303: Interaction between the Xce (X-controlling element) locus and imprinting of the paternal X chromosome in mouse yolk-sac endoderm.

3 Modelo sencillo de expresión mono-alélica de dos genes sujetos a imprinting
en el esquema se muestra solamente un autosoma y sus marcas epigenéticas (*) Erasure = borrón y cuenta nueva “resetting” del imprinting epigenéticamente iguales origen: P M origen: P M epigenéticamente iguales se mantienen las marcas que vinieron de los progenitores. no importa el sexo del individuo hijo (el sexo va a importar después a la hora de transmitir los alelos a su progenie) las marcas se establecen de nuevo de acuerdo a si son gametas masculinas o femeninas 3

4 ERASURE “borrón y cuenta nueva”
Andy Bell y Vince Clarke.)

5 marcas epigenéticas de
y cel somaticas de adulto “resetting”: se borra el viejo imprinting y se establece nuevo imprinting marcas epigenéticas de futura no-expresión marcas epigenéticas de futura expresión 5

6 Lista de genes “imprinteados”
en: a census of mammalian imprinting. Morison et al., Trends Genet. 21: (2005 ) Ejemplos: cromosoma expresión SNRPN UBE3A 15 paterna materna IGF2 H19 11 Xist Tsix X paterna* materna* 1 2 3 * Solamente en embrión antes de implantación; después es al azar

7 Ejemplo 1: cromosoma 15q11-q13 (brazo largo)
son genes que se expresan en sistema nervioso central IC SNRPN _______otros genes _________UBE3A ← Kb → expr. paterna expr: materna IC: “imprinting center”: region que controla el imprinting de toda la región SNRPN y UBE3A son de expresión excluyente en cis, es decir: si se expresa SNRPN, no se expresa UB3A en el mismo alelo, y viceversa

8 Geuns et al., Hum. Mol. Genet. 12: 2873-9 (2003)
¿En qué células se establece (se “resetea”) el imprinting del gen SNRPN? metodología: medición de status de metilación en islas CpG (entre ellas, las del IC=Imprinting Center) mediante la técnica del bisulfito Geuns et al., Hum. Mol. Genet. 12: (2003) embrión temprano línea germinal femenina consistente con un alelo metilado y el otro no muy metilada línea germinal masculina nada metilada

9 Síndrome de Prader Willi (PWS)
Causa 1: deleción en el alelo SNRPN de origen paterno  (70% de los casos) Expresión NO NO de la región

10 Síndrome de Prader Willi (PWS)
causa 2: Disomía* Maternal (25% de los casos) *Disomía uniparental en general puede surgir por: 1) error en meiosis dando gametas con cromosomas duplicados provenientes de un mismo progenitor y posterior pérdida en cigoto del cromosoma heredado del otro progenitor 2) o por recombinación entre cromosomas homólogos en mitosis en embrión temprano Expresión: NO NO

11 Síndrome de Prader Willi (PWS)
causa 3: Defecto en el IC 3’ (PWS-IC) de origen paterno, que (si bien causa insensibilidad a marcas epigenéticas inactivadoras), tampoco permite que actúen las marcas activadoras (5% de los casos) Expresión: NO NO

12 Página de PWS association http://www.pwsausa.org/index.html
Síntomas Neonatal hypotonia Feeding problems in infancy Excessive weight gain Facial features Hypogonadism Developmental delay Hyperphagia Hypopigmentation Small hands and/or feet Eye abnormalities Thick viscous saliva Articulation defects problemas de comportamiento Sleep disturbance

13 Síndrome de Angelman (AS) Causa similar pero la deleción es en la región que se expresa a partir del alelo de origen materno: gen UBE3A Angelman Syndrome Foundation

14 Síndrome de Angelman (AS)
Síntomas developmental delay mental retardation gross and fine motor difficulties suck/swallowing disorder wide-spaced teeth hypopigmentation Problemas de comportamiento speech disorder (in most cases, lack of speech) hypermotoric behavior easily excitable personality frequently happy demeanor.

15 Modelo molecular sencillo para explicar expresión mono-alélica (paterna) de los genes de la región (excepto de UBE3A, que tiene patrón de expresión opuesto en cis) p _____ _____ factores específ de línea germ fem metilación → inactivo IC = Imprinting Center; región regulatoria bipartita: parte 5’ (AS-IC): promueve la acción de metilasas; parte 3’ (PWS-IC): isla CG receptora de esas metilasas no hay factores sin metilar → activo ● : alelos que no se expresan ○ : alelos que se expresan IC = Imprinting Center

16 ¿Por qué la expresión excluyente en cis entre SNRPN y UBE3A?
No hay un modelo molecular convincente, pero probablemente se deba a un aislante transcripcional influido por una DMR (región diferencialmente metilada) que actúa a distancia,de modo similar a lo indicado en el ejemplo 2 (BWS)

17 - Ejemplo 2: Beckwith–Wiedemann syndrome (BWS): ●
- macroglosia - hepatomegalia - tumor de Wilms - se transmite por vía materna no se preocupen por el * (portadores de la mutación) en las personas sanas de la generación III ● CTCF es un aislante transcripcional que se ubica en la DMR (región diferencialmente metilada) cuando no está metilada; e impide la acción a distancia del enhancer sobre IGF2 (CTCF no tiene efecto sobre H19, pero éste requiere DMR no metilada) región en cromosoma 11p15: genes IGF2 y H19 (no relacionado a la enfermedad) regulados por el mismo enhancer atípico ubicado 3’ Normalmente el alelo paterno está metilado → CTCF no se pega → IGF2 se expresa enhancer CTCF Normalmente el alelo materno no está metilado → CTCF se pega → IGF2 no se expresa En BWS, el alelo materno tiene una deleción en DMR → CTCF no se pega → IGF2 se expresa, lo cual explica el tumor de Wilms (sobre-expresión de IGF2 a partir de ambos alelos) Si hay deleción similar en alelo paterno, no causa cambios en la expresión de IGF2 porque desaparece la plataforma para el pegado de CTCF, que igual normalmente es inefectiva debido a metilación

18 Ejemplo 3 INACTIVACION DEL CROMOSOMA X en células XX de mamíferos
Mary F. Lyon, UK ( ) antecedentes: descubrió en 1966 que: corpúsculo de (Murray) Barr (1949), es debido a un X como heterocromatina en células somáticas XX en interfase sexado en las Olimpíadas (para detectar transexuales XY): the presence of Barr bodies indicates femaleness whereas their absence indicates maleness. This test was previously used in the International Olympic Committee Medical Commission in This test later was replaced by PCR (Y chromosome). cuerpo XY (par XY como heterocromatina [hay recombinación homóloga entre ellos solamente en cortas regiones]) en células germinales masculinas durante el inicio de la meiosis; luego se separan en la primera división, pero el X sigue heterocromatinizado en las gametas masculinas con X

19 Ejemplo 3 INACTIVACION DEL CROMOSOMA X en células XX de mamíferos
Placentarios (euterianos) debida a imprinting hasta el momento de la implantación (estadío blastocisto). Después el imprinting es borrado (excepto en trofoblasto → placenta) y la inactivación es al azar por un mecanismo de conteo o dosaje → tejidos mosaico No placentarios (metaterianos) p. ej. canguros hay imprinting de todo el X paterno a lo largo de toda la embriogénesis, que continua en la vida adulta

20 locus definido por genética clásica
Genes Xist y Tsix Jeannie Lee et al., Harvard Medical School Nature Genetics  21, (1999) los genes responsables están localizados en el XIC (X-inactivation Center), locus definido por genética clásica El RNA Xist (un long ncRNA) recubre a todo el X del cual provino, y lo inactiva (indirectamente) El RNA Tsix (otro long nc RNA), más largo, es complementario a Xist (parcialmente solapados); impide que se sintetice RNA Xist RNA: el verdadero inactivador en cis RNA anti-sense: el verdadero activador en cis se detecta Xist se detecta Tsix hibridización in situ de RNA (RNA-FISH)

21 ¿Qué marcas epigenéticas adquieren los X como consecuencia del RNA Xist?
los clásicos RNA Chang et al., Frontiers in Bioscience 11, , 2006

22 OK, la inactivación de uno de los dos X es debida a genes del XIC…
OK, la inactivación de uno de los dos X es debida a genes del XIC…. pero ¿cuál X es el que se inactiva?¿Es al azar o es parent of origin? Experimento: mirar expresión de genes Xist y Tsix por RT-PCR sobre RNA de blastocistos pre-impl. de dos cepas de ratón distintas (para aprovechar polimorfismos de longitud en RNA Xist y Tsix) Madre Padre M P F1 en hembras: el RNA Xist es igual al de la cepa del padre !!! machos no tienen RNA Xist el RNA Tsix es el de la madre !!! Conclusión: en blastocistos XX pre-implantados, el X inactivo es el de origen paterno el X activo es el de origen materno controles de expresión de un gen del Y y constitutivos

23 ¿Qué le pasa a la progenie de una madre sin Tsix
¿Qué le pasa a la progenie de una madre sin Tsix? (KO para Tsix, en región que no afecta al DNA Xist) M P M P F1 *aparece el RNA Xist de la madre!!! * **obviamente desaparece Tsix de la madre si el KO fue exitoso ** Jeannie Lee, Harvard

24 Mirando los blastocistos pre-implantación wt y KO detección de RNA Xist mediante RNA-FISH
¿consecuencias de este KO en la vida de los ratones? en los pocos embriones XX que sobreviven, después de la implantación y borrón y cuenta nueva: se inactiva 1 solo X, pero no al azar: preferentemente es en el X mutado (y en machos sobrevivientes, el único X no se inactiva?) estos embriones mutantes knock out tienen problemas de superviviencia: se les inactiva el XM que tendría que estar activo !! Jeannie Lee, Harvard Cell 103, 17–27 (2000) En cambio, los mutantes XM XPΔ no tienen problemas porque de todos modos XP estaría inactivo en estas ratonas, después de la implantación, la inactivación del X no es al azar: preferentemente es el X mutado

25 Modelo sencillo de inactivación del cromosoma X
muestra que el imprinting de todo el X (antes de la implantación) se deberia al imprinting de Tsix (en su IC) (trofoblasto→placenta) femenino borrón y cuenta nueva metilación? IC = Imprinting Center Modelo consistente con la formación del corpúsculo XY en células germinales masculinas diploides y el borrado del corpúsculo del de Barr en las germinales femeninas

26 modelo integrador que muestra asociación entre RNAs Xist/Tsix y marcas epigenéticas conocidas en el embrión mamífero XX temprano RNA Xist origen Paterno origen Materno Navarro et al. GENES & DEVELOPMENT (2005) 19: Tsix induces efficient H3-K4 methylation ○ over the entire Xist/Tsix unit. RNA Tsix / / borrón y cuenta nueva / Ojo!!!: metilación en K4H3 es marca activadora al azar RNA Xist RNA Xist

27 Comprobación experimental (in vivo) del “modelo del beso” (Jeannie Lee, Science 2006)
MEFs núcleos de ES cells XX Xic, green Tsix, red. DAPI, blue para ver resto del nucleo luego de extraer los embriones a distintos tiempos (de distintas ratonas preñadas) : DNA FISH para ambos X (verde y rojo) ocurrió “beso” se separan Xic DNA, green Xist RNA, red Enriquecimiento de K27H3 en cromosoma con Xist RNA RNA FISH para Xist (rojo): se ve En 1 X solamente al momento del “beso”

28 Modelos de inactivación al azar del cromosoma X en mamíferos
Enjambre de factores bloqueadores de la inactivación, que quedan finalmente agregados y unidos a 1 solo X

29 Symmetry-Breaking Model for X-Chromosome Inactivation
modelado b) del “enjambre” de la diapo anterior mediante simulación computacional Mario Nicodemi & Antonella Prisco PHYSICAL REVIEW LETTERS (2007) Variables independientes a setear:: constante cinética de difusion "k" de Arrhenius E = energía de “pegado” entre moléculas de factor de activación (valor alto = molec. “pegajosa”) distancia entre los dos X tiempo un X el otro X Variable dependiente (output): distribución de moléculas en cada X When E = 0, a random walk diffusion is found. The evolution is drastically different for E = 2.4kT, where droplets (swarm) of particles are formed, ending up in a single cluster overing just one of the two equivalent chromosomes and, thus, breaking their binding symmetry. a medida que van apareciendo moléculas regulatorias…. El modelo encaja mejor cuanto menor sea la distancia entre los dos Xs, consistente con el modelo intuitivo del beso La molécula pegajosa de este modelo bien podria ser un activador de Tsix. Channnn!

30 Y en insectos? es al revés que en mamiferos:
Weake & Workman, Nature Structural & Molecular Biology 16, (2009) hay un complejo proteico acetilador de histonas (HAT) en células de machos que garantiza la doble expresión de genes en el único cromosoma X para igualar el nivel de expresión en hembras que tienen dos X !!

31 Para tener en cuenta…. los genes sujetos a imprinting evaden las oleadas de metilación y desmetilación que ocurren en la reprogramación epigenética en el desarrollo embrionario temprano en mamíferos El imprinting puede perderse en animales clonados por transferencia nuclear porque se forma un cigoto “parcialmente asexual” que no se originó a partir de ambas líneas germinales, donde normalmente se establecen las marcas de imprinting Se ha revelado el “imprintoma” de cerebro de ratón adulto (Gregg et al, agosto 2010): cruzas de ratones endocriados de dos diferentes cepas (para aprovechar polimorfismos y así después rastrear el origen parental). En las crías F1 (heterocigotas) se hizo RNA-seq masiva (pirosecuenciación de todos los cDNAs). Se observó sesgo en la expresión materna o paterna de 1300 loci.

32 2) Hipótesis evolutiva del “Conflicto Genético”
¿Y la ventajas adaptativas del imprinting? Morison et al., Trends Genet. 21: (2005) Difíciles de hallar pues el imprinting hace perder la obvia ventaja de la diploidía 1) Hay una teoría (Ishino, Develop. Growth Diff., 2010), que sostiene que el imprinting surgió en la evolución como defensa contra retrotransposición en una de las dos líneas germinales (en ambas hubiera sido letal en la descendencia). Los autores la fundamentan invocando a los genes parental expressed genes (peg), sujetos a imprinting, que tienen DMRs con similitud de secuencia a los de retrotranposones 2) Hipótesis evolutiva del “Conflicto Genético” (“cierra” para IGF2, pero no para IGF2-Receptor, que tiene el patrón de imprinting opuesto) En especies que muestran paternidad mútiple en 1 evento reproductivo (“poliandria”)…. cada padre intenta privilegiar su propia paternidad a través del tamaño de su propia descendencia, rivalizando con los otros padres. Y lo hace transmitiendo epialelos activos de genes que promueven el crecimiento fetal, p. ej. IGF2. un interés de la madre es distribuir equitativamente sus recursos en toda su progenie, aunque nazcan pequeños. Y lo hace transmitiendo epialelos inactivos de genes que promueven el crecimiento fetal, p. ej. IGF2. Además, en el caso de IGF2, la ausencia de imprinting causaría su “sobre-expresión” (bi-alélica, como en la mayoría de los genes) y mayor propensión al tumor de Wilms, como sucede en BWS