PCR y Secuenciación de ADN con los cebadores D2A –D3B y 18s-rDNA1

Presentación del tema: "PCR y Secuenciación de ADN con los cebadores D2A –D3B y 18s-rDNA1"— Transcripción de la presentación:

1 PCR y Secuenciación de ADN con los cebadores D2A –D3B y 18s-rDNA1
IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA, MORFOMÉTRICA Y MOLECULAR DE CUATRO ESPECIES DE PRATYLENCHUS (NEMATODA:PRATYLENCHIDAE) DE COSTA RICA Zamora-Araya, T1., Peraza-Padilla, W2., Archidona-Yuste, A3.,Cantalapiedra-Navarrete, C4.,Liébanas-Torres, G5., Palomares-Rius, JE6.,Castillo-Castillo, P7. INTRODUCCIÓN A B C D Existen diversos factores que afectan la producción de los cultivos. Se estima que las pérdidas producidas por nematodos corresponden al 12%. El ataque de patógenos es un elemento que condiciona los rendimientos y la productividad de una plantación (González et al. 2007). La correcta identificación de las especies de nematodos representa un elemento fundamental en el establecimiento e implementación de una estrategia de manejo que minimice los daños ocasionados por estos organismos. Por lo anterior, el objetivo de esta investigación fue realizar un estudio taxonómico (morfológico, morfométrico mediante microscopía de luz y microscopia electrónica de barrido (SEM)) así como un análisis molecular por medio de PCR-RFLP y secuenciación para la identificación de especies de Pratylenchus asociadas a café (Coffea sp.), helecho (Rumohra adiantiformis), crisantemo (Chrysanthemum sp.) y arroz (Oryza sativa), en dos regiones de Costa Rica. METODOLOGÍA Toma de muestras de los cultivos de café (Coffea sp.), helecho (Rumohra adiantiformis), crisantemo (Chrysanthemum sp.) y arroz (Oryza sativa) Extracción de poblaciones de Pratylenchus de suelo y raíz por el método de tamizado y centrifugación en solución azucarada (Caveness y Jensen 1955). Figura 2. Región anterior y Posterior. A. P. bolivianus. B. P. gutierrezi. C. P. pseudocoffeae. D. P. zeae. Preparación y observaciones de Pratylenchus en el microscopio electrónico de barrido (SEM) Descripción morfológica y morfométrica de machos y hembras de Pratylenchus Pruebas moleculares: Amplificación de los segmentos de expansión D2-D3 de la región 28S del rDNA y la región ITS1 Reacción en Cadena de la Polimeraza (PCR) con los cebadores rDNA2 y rDNA1.58S. PCR y Secuenciación de ADN con los cebadores D2A –D3B y 18s-rDNA1 Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP) con las enzimas de restreción Ded-I, Hind-III y Pst-I Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP) con las enzimas de restricción Ded-I, Hind-III y Pst-I Análisis filogenéticos (Máxima Verosimilitud (MV) e Inferencia Bayesiana (IB)) Figura 3. Gel de agarosa al 1.5 %. Productos de PCR con los imprimadores rDNA2 y rDNA1.58s. M1: Marcador molecular de 100 pb. M2: Marcador molecular de 50 pb. RESULTADOS CONCLUSIONES A B La especie P. bolivianus se reporta por primera vez en Costa Rica y la especie P. pseudocoffeae se encontró por primera vez asociada al cultivo de crisantemo. Estos datos proporcionan información valiosa principalmente en asuntos cuarentenarios. En lo que respecta a los resultados obtenidos de las pruebas moleculares de PCR-RFLP, se lograron generar nuevos patrones de bandas de ADN para las especies de P. gutierrezi; P. bolivianus y P. pseudocoffeae. Por más de diez años las especies P. gutierrezi (Costa Rica) y P. panamaensis (Panamá) fueron sinonimizadas (Castillo y Vovlas 2007). Mediante esta investigación, se logró comparar molecularmente y llegar a la conclusión de que en realidad ambas especies son crípticas. La detección de especies de nematodos en plantaciones agrícolas permite el establecimiento e implementación de una estrategia de manejo que minimice los daños ocasionados por estos organismos. El combate depende de la eficiencia de la técnica empleada, de una correcta identificación del agente causal, así como del cultivo afectado y de los elementos ambientales. C D Figura 1. Regiones Labiales de las poblaciones de Pratylenchus identificadas en este estudio. A. P. bolivianus. B. P. zeae. C. P. gutierrezi. D. P. pseudocoffeae. 1Tatiana Zamora Araya y 2Walter Peraza Padilla. Universidad Nacional. Laboratorio de Nematología, Escuela de Ciencias Agrarias. Correo electrónico: 3Antonio Archidona-Yuste; 4Carolina Cantalapiedra-Navarrete; 6Juan E. Palomares-Rius y 7Pablo Castillo. Instituto de Agricultura Sostenible (IAS), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). España. Correo electrónico: 5 Gracia Liébanas. Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología. España. Correo electrónico: Universidad de Jaén. González C, C., Aristizábal L, M., Aristizábal H, JC Dinámica poblacional de nematodos fitopatógenos en plátano (Musa AAB) Dominico Hartón. Agronomía. 15(2):25-31. Castillo, P y Vovlas, N Pratylenchus (Nematoda: Pratylenchidae): Diagnosis, Biology, Pathogenicity and Management. Eds. DJ Hunt; RN Perry. Brill Leiden-Boston. 529p.