Aspectos técnicos del diagnóstico de VIH

Aspectos técnicos del diagnóstico de VIH
David Dalmau* y Piedad Arazo** * Hospital Mutua Terrassa. Barcelona ** Hospital Miguel Servet. Zaragoza

Contenido Métodos indirectos o serológicos
Métodos directos o virológicos Pruebas de detección rápida Pruebas de cribado o screening y pruebas de confirmación Período ventana

CICLO DE REPLICACIÓN DEL VIH
El proceso de entrada se inicia con la interacción entre la glicoproteína viral gp120 y la molécula de CD4, que se expresa preferentemente en linfocitos, macrófagos y células dendríticas. Una vez fusionadas las membranas viral y celular, se produce la internalización de la nucleocápside y la decapsidación del genoma vírico. En este proceso, las proteínas de la cápside se desensamblan y liberan el genoma viral al citosol. El proceso de síntesis de ADN a partir del ARN viral o retrotranscripción es realizado por el complejo enzimático de la transcriptasa inversa, que efectúa la síntesis de una doble hebra de ADN a partir del ARN genómico. A partir del estado de provirus integrado, la replicación del VIH comienza mediante la transcripción del genoma viral. A partir de ese momento, la célula empezará a producir todos los elementos necesarios (proteínas, enzimas, nuevo material genético,…) que permitirán el procesamiento y transporte de nuevos viriones. La maduración ﬁnal de los viriones, traducción, ensamblaje y salida de las proteínas virales se produce durante el proceso de gemación a través de la membrana celular y mediante la acción de la proteasa viral.

VIH-1. GRUPO M 11 subtipos / 2 sub-subtipos
Sec a.a. 35% intergrupo 20%-30% intersubt 20% intrasubt 10% cuasiesp 11 subtipos / 2 sub-subtipos 15 Formas Circulantes Recombinantes (CRFs) (1994 Brasil BF)

VIH-1. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
El VIH-1 del grupo M, el más prevalente, contiene 11 subtipos y 2 sub-subtipos, que comportan 15 formas circulantes recombinantes. Estas distintas recombinaciones constituyen el factor más importante en la generación de diversidad viral desde los inicios de la pandemia. Esta diversidad genética comporta implicaciones biológicas tanto en la transmisión y patogenia del virus, como en las pruebas diagnósticas, en el tratamiento, en la resistencia a los fármacos antiretrovirales y en el diseño de vacunas contra el VIH.

MOLECULAR BIOLOGY OF HIV
Historia natural del VIH y cinética de sus marcadores MOLECULAR BIOLOGY OF HIV Plasma HIV RNA Anti-HIV Ab p24 antigen Meses Años después infección VIH Dias Durante la primoinfección se detecta una alta replicación viral, y diseminación generalizada del VIH con afectación especialmente ganglionar y del sistema nervioso, y con una importante caída en la cifra de linfocitos CD4. Tras este periodo ventana, se produce una respuesta inmune especifica frente al VIH por lo que se detectan tanto anticuerpos específicos como linfocitos CD8 con actividad citotóxica frente al VIH, ocurre por tanto la seroconversión, y con ello la posibilidad de diagnosticar la infección por el VIH mediante test de detección de anticuerpos. Esta respuesta específica logra una disminución sustancial del desarrollo del VIH con bajada muy importante de la carga viral circulante y una recuperación parcial de cifras de CD4, aunque sin conseguir erradicar al virus. Este equilibrio, con un control aparentemente fácil del VIH y cifras estables de CD4 dura un tiempo prolongado, habitualmente más de 10 años. Pero finalmente la balanza se inclina a favor del VIH, con aumento de la replicación viral, produciéndose un lento y progresivo descenso de la cifra de CD4 hasta niveles de riesgo para padecer determinadas infecciones oportunistas. DNA PCR RNA PCR 8-17 días* p24 Ag 12-26 días* Anti-HIV 20-45 días* * from ANAES Report January 2000

Diagnóstico de laboratorio de la infección por el VIH
Métodos directos Cultivo viral Antigenemia p24 Detección de ácidos nucléicos Métodos indirectos Pruebas de detección o cribado Pruebas de detección rápida Pruebas de confirmación El diagnóstico de la infección por VIH sólo se puede establecer de modo definitivo por métodos de laboratorio, ya que las manifestaciones clínicas son inespecíficas en cualquier estadio de la enfermedad. Las pruebas de laboratorio utilizadas pueden clasificarse en directas e indirectas. 1.-Los métodos directos persiguen demostrar la presencia del virus o de sus constituyentes. Se utilizan cuando no es posible o no son suficientes los métodos serológicos. Entre éstos cabe destacar el cultivo viral, la determinación del antígeno p24 y la detección de ácidos nucleicos, más conocido como la determinación de la carga viral (RNA del VIH). 2.-Los métodos indirectos detectan la respuesta inmunitaria (humoral o celular) del huésped, bien mediante la detección de anticuerpos específicos del virus o bien mediante la investigación de la inmunidad celular. Dentro de los métodos de detección de anticuerpos específicos están las pruebas de detección (screening) y las pruebas de confirmación destinadas a validar o rechazar los resultados de las primeras.

Métodos directos Cultivo viral Procedimiento complejo con sensibilidad muy variable en los distintos estadios de la infección y en distintos laboratorios. Antigenemia p24 Detección del antígeno p24 del virus. El cultivo viral es una de las técnicas más específicas para el diagnóstico de la infección por retrovirus. Aunque constituye la mejor evidencia de la infección viral, la sensibilidad de este complejo procedimiento es muy variable en los distintos estadios de la infección por VIH y en distintos laboratorios. Es particularmente útil en el diagnóstico de la infección pediátrica y ante la sospecha de infección silente, ya que la presencia de anticuerpos maternos en el primer caso y ausencia de anticuerpos en el segundo podría conducir a un diagnóstico erróneo. La antigenemia p24 consiste en la detección del antígeno p24 del virus. Esta técnica se encuentra limitada al diagnóstico en el período ventana en casos de presencia de signos clínicos sospechosos de primoinfección o en casos de exposición conocida o sospechosa.

Métodos directos Detección de ácidos nucléicos Detección de material genético del virus mediante amplificación por PCR Carga viral plasmática: cantidad de ARN del virus por mL de plasma. Las técnicas ultrasensibles pueden llegar a detectar hasta copias/mL. La detección de ácidos nucleicos comporta la identificación del material genético del virus mediante amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) tanto de moléculas de ARN de la partícula viral como del ADN pertenecientes al provirus integrado en el genoma celular. Son técnicas capaces de cuantificar el virus en plasma, suero o incluso tejido. La posibilidad de cuantificar a contribuido significativamente a la comprensión de la patogénesis y a la evaluación del beneficio de los tratamientos (información crucial para el control de las personas infectadas). Existen ciertas situaciones, especialmente cuando la serología no aporta un resultado definitivo, ante la sospecha de primoinfección y en los recién nacidos de madre infectadas por VIH-1, en las que estas técnicas consiguen un diagnóstico más rápido y precoz que el diagnóstico serológico. Lo que realmente detecta esta prueba es la cantidad de ARN del virus presente en cada mililitro de plasma (carga viral plasmática). Las primeras técnicas comerciales introducidas tenían una menor sensibilidad que las actuales, no pudiendo llegar a detectar, en ocasiones, valores inferiores a 400 copias/mL. Las actuales, también llamadas ultrasensibles pueden llegar a detectar hasta copias/mL. Aunque las pruebas iniciales sólo detectaban algunos subtipos, actualmente son capaces de detectar, prácticamente, todos los subtipos de VIH-1.

Métodos directos Detección de ácidos nucléicos Indicaciones de uso: Monitorización del tratamiento antirretroviral Predicción de la progresión Valoración del riesgo de transmisión Diagnóstico de la infección aguda Las indicaciones de uso de la PCR son las siguientes: 1.-Monitorización del tratamiento antirretroviral: Es el uso más habitual que se le da a la determinación de la carga viral plasmática (CVP). Una vez instaurado el tratamiento antirretroviral la CVP disminuye rápidamente en las primeras semanas y algo más lentamente a partir del primer mes de tratamiento. 2.-Predicción de la progresión: En pacientes crónicamente infectados y en el inicio del tratamiento. 3.-Valoración del riesgo de transmisión: La CVP se correlaciona con el riesgo de transmisión del VIH por cualquiera de sus vías de transmisión. De esta manera, cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisión. Aunque no puede excluirse completamente, la transmisión del VIH tanto por contacto sexual como por punciones accidentales con agujas, es poco probable por debajo de 1500 copias/mL y esta cifra, junto con las características de la exposición forma parte de los condicionantes que establecen diferentes pautas de profilaxis postexposición. 4.-Diagnóstico de infección aguda: Durante las primeras semanas de infección los anticuerpos específicos anti-VIH no son detectables por las técnicas diagnósticas rutinarias. Sin embargo, la replicación del virus es muy activa en ese momento y alcanza su máximo alrededor de los 10 días postinfección, lo que a menudo coincide con la fase sintomática. Para cubrir este periodo, alguna técnica de cribado combina la detección conjunta de anticuerpos y antígeno (p24) específicos. Aunque formalmente las técnicas para la determinación de CVP del VIH no tienen un diseño cualitativo (positivo-negativo), dada su sensibilidad se utilizan frecuentemente para cubrir el diagnóstico de una posible infección aguda por el VIH. Si bien la sensibilidad de la técnica para este propósito es excelente, conviene tener en cuenta la eventualidad de resultados falsamente positivos. Generalmente, la viremia durante las primeras semanas de la infección es muy elevada, en general > copias/mL, por lo que deben interpretarse con muchas reservas los resultados con valores bajos (< copias/mL).

Métodos indirectos Detectan la respuesta inmunitaria (humoral o celular) del huésped, bien mediante la detección de anticuerpos específicos del virus o bien mediante la investigación de la inmunidad celular

Métodos indirectos Pruebas de detección o cribado Son las que primero se realizan y sirven para descartar los resultados negativos Precisan confirmación aquellas que han sido positivas El enzimoinmunoensayo (EIA) es el método más utilizado como método de cribado Las pruebas de detección o cribado son las pruebas que primero se realizan y sirven para descartar los resultados negativos. Únicamente precisarán confirmación aquellas que han sido inicialmente positivas. Existen distintos métodos de cribado (EIA, aglutinación, adherencia, análisis por dot-blot). El EIA es el método más utilizado como método de cribado.

VIH-1. Diagnóstico indirectos
Los antígenos provienen del lisado viral de un cultivo (EIA de 1ª generación) o bien corresponden a proteínas recombinantes o péptidos sintéticos (EIA de 2ª generación). Los EIA de 2ª generación son más sensibles y sobretodo más específicos que los de 1ª generación. La evolución de los antígenos incluidos en las pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH ha permitido por una parte incrementar la sensibilidad sin merma de la especificidad y por otra ha hecho posible la detección de anticuerpos frente tipos y subtipos del VIH que escapaban a los equipos de diagnóstico habituales. A pesar de las mejoras introducidas en los equipos actuales, debe tenerse en cuenta la posibilidad real de encontrar sueros de pacientes infectados por subtipos inusuales del VIH, sobre todo en pacientes africanos o en personas con estancias prolongadas en ese continente.

Métodos indirectos Pruebas de detección o cribado EIA 3ª generación detecta todas las subclases de anticuerpos y no sólo las IgG  mayor sensibilidad para reconocer la primoinfección (IgM) y para el diagnóstico de la infección pediátrica (IgM e IgA). EIA 4ª generación detecta al mismo tiempo al antígeno p24 y a los Ac frente al VIH  acortamiento del período ventana. En los últimos años, las dos técnicas principales son el EIA tipo sandwich (EIA de 3ª generación) y el EIA de captura que pueden detectar todas las subclases de anticuerpos y no sólo la IgG. Esto explica su mayor sensibilidad para reconocer la primoinfección por el VIH-1 (IgM) y para el diagnóstico de la infección pediátrica (IgM e IgA). La última aportación a las pruebas inmunoenzimáticas ha sido la detección simultánea de antígeno p24 y anticuerpos frente al VIH (EIA de 4ª generación), lo que acorta el período ventana, aspecto a considerar si tenemos en cuenta que en el período ventana la infectividad de un individuo es más elevada.

Métodos indirectos Pruebas de detección o cribado PRUEBAS DE DETECCIÓN RÁPIDA Emplean antígenos similares a los EIA Obtención del resultado entre 1 y 20 minutos Algunas pueden hacerse en saliva o en sangre completa Sensibilidad comparable a las técnicas de cribado, especificidad algo menor Inconveniente: LECTURA SUBJETIVA Entre las pruebas de cribado de anticuerpos VIH, las denominadas pruebas rápidas han experimentado un desarrollo importante; los antígenos que emplean son similares a los EIA y el tiempo en el que se puede obtener un resultado oscila entre 1 y 20 minutos, tiempo significativamente menor en comparación con las pruebas de cribado que conllevan una cierta demora en su realización, normalmente horas. Por tanto, las pruebas de cribado o detección rápida permiten efectuar un diagnóstico precoz de la infección por el VIH. Algunas de ellas pueden ser realizadas en la saliva o con sangre total, por lo que no requieren ninguna manipulación de la muestra y pueden ser llevadas a cabo en cualquier lugar, incluso a pie de calle. Otras, por el contrario, al realizarse en suero o plasma, obligan a la centrifugación de la muestra y deben efectuarse en el laboratorio.

VIH-1. Diagnóstico PRUEBAS RÁPIDAS indirectos
La mayoría de las pruebas de detección rápida del VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario para la realización de la prueba. En general, disponen de un control de procedimiento incorporado en el kit.

Procedimiento de la prueba instantánea INSTITM (IV)

PRUEBAS DE DETECCIÓN RÁPIDA Para ser ideal debería reunir los siguientes criterios: Alta sensibilidad y especificidad (>99%) Ser reproducible Ser fácil de aprender, realizar e interpretar Ser precisa Ser de fácil almacenamiento No requerir equipamiento adicional No tener carácter invasivo En general, las pruebas rápidas utilizan péptidos recombinantes del VIH-1 y VIH-2, que detectan anticuerpos frente a los mismos antígenos mediante EIA, aglutinación o inmunocromatografía. Las basadas en el principio de la inmunocromatografía capilar tienen mejor sensibilidad y especificidad. Fundamentalmente aportan ventajas en aquellos lugares donde los tests diagnósticos habituales son de difícil incorporación. Su capacidad para detectar las distintas variantes del VIH-1 y VIH-2, hace que su uso en África esté cada vez más extendido, sobre todo para diagnósticos urgentes. Aunque la sensibilidad de los nuevos tests es comparable a las técnicas de cribado, la especificidad es algo menor. Su mayor inconveniente reside en la lectura que siempre es subjetiva y con algunos sueros pueden producirse reactividades que generen dudas de interpretación.

PRUEBAS DE DETECCIÓN RÁPIDA
Diagnóstico de laboratorio de la infección por el VIH PRUEBAS DE DETECCIÓN RÁPIDA Resultado negativo Resultado reactivo Resultado indeterminado Negativo definitivo (salvo periodo ventana) Debe confirmarse mediante EIA o Western Blot Repetir la prueba en un mes Durante las pruebas de detección rápida se recomienda que las personas reciban información y asesoramiento sobre la enfermedad y la infección. Si el resultado del test es negativo se considera un negativo definitivo, a no ser que la persona se encuentre en el período ventana de exposición (primeros tres meses postexposición). Si el resultado es positivo (a partir de ahora lo llamaremos reactivo para no confundir al usuario pues requiere confirmación) se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con la prueba Western Blot (se explica en el siguiente apartado) o con técnicas de EIA. Los resultados indeterminados hay que repetirlos en un mes.

Pruebas de Detección. EIA Causas de Falsos Positivos
VIH-1. Diagnóstico indirectos Pruebas de Detección. EIA Causas de Falsos Positivos Relativas al Suero Congelación-descongelación Almacenamiento a tª subóptima Aspecto lipídico, turbio o hemolizado Contaminación microbiana Tratamiento con calor >60ºC Error de extracción o identifiación Esta diapositiva resume las principales causas de falsos positivos en las pruebas de detección basadas en enzimo-inmuno análisis (EIA) debidas a problemas en el suero

VIH-1. Diagnóstico indirectos Pruebas de Detección. EIA Causas de Falsos Positivos Relativas a la Presencia de Autoanticuerpos Anticuerpos anti-HLA-DR4, DQw3 Enfermedades reumatoideas Polimiositis Lupus eritematoso Multitrasfundidos Trasplantados renales Multíparas Esta diapositiva resume las principales causas de falsos positivos en las pruebas de detección basadas en enzimo-inmuno análisis (EIA) debidas a problemas relacionados con la presencia de autoanticuerpos.

VIH-1. Diagnóstico indirectos Pruebas de Detección. EIA Causas de Falsos Positivos Relativas a Otras Condiciones Hemodializados Sd. Stevens-Johnson Administración previa de inmunoglob Vacunación previa (gripe, hepatitis B) Enf. Hepática alcohólica grave Cadáver Esta diapositiva resume las principales causas de falsos positivos en las pruebas de detección basadas en enzimo-inmuno análisis (EIA) debidas a otras condiciones.

Métodos indirectos Pruebas de confirmación: Western Blot Es la más utilizada Es altamente específica (1/ falsos positivos y 1/ falsos negativos) Puede dar tres tipos de resultados La trascendencia de la infección por el VIH hace necesaria la confirmación de los resultados positivos obtenidos en las pruebas de detección primaria de anticuerpos; este paso es inexcusable cuando el objetivo de las pruebas sea el diagnóstico y puede ser obviado cuando aquellas se realicen para seguridad biológica. Sin embargo en el ámbito hospitalario es cada vez más frecuente que se confirmen todos los resultados positivos de sueros u otras muestras, incluidas aquellas en las que el objetivo principal no es el diagnóstico. Existen diferentes pruebas de confirmación, la más frecuentemente utilizada es la de inmunotransferencia o Western Blot. Básicamente, se basa en la separación de las proteínas (antígeno) obtenidas del VIH-1 procedentes del lisado del cultivo del virus y purificadas por centrifugación.

Métodos indirectos Pruebas de confirmación: Western Blot Positivo: presencia de ciertas bandas Negativo: ninguna banda presenta reacción Indeterminado: ni positivo, ni negativo Por lo general, cada uno de los distintos equipos comerciales que existen para la realización de la prueba, contienen instrucciones precisas de cómo interpretar los resultados obtenidos con unos criterios de positividad o negatividad más o menos restrictivos y sus tiras pueden contener un número variable de bandas, cada una de las cuales indica una proteína específica del virus (gp 160 precursor de la envoltura, p24 proteína principal, etc). Se considera el Western blot como una prueba sensible para las proteínas del core y algo menos para las de la envoltura. Por ello, durante la primoinfección, por la escasez de anti-p24 o anti-gp41, es una prueba poco sensible como los EIA, algo similar ocurre en las fases terminales por la pérdida de anti-p24.

Un resultado indeterminado en el Western Blot del VIH-1 suele corresponder, por lo menos, a siete situaciones distintas: Infección por el VIH-2. Durante el proceso de seroconversión por el VIH-1. Enfermedad avanzada. Niños nacidos de madres seropositivas. Individuos africanos (divergencia genética de las cepas). Reactividad inespecífica o cruzada con otros anticuerpos. Individuos tratados con antirretrovirales con cargas virales indetectables.

Si aparece un resultado indeterminado en el Western Blot: Interrogar sobre potenciales fuentes de exposición recientes al VIH Repetir EIA y Western Blot a los 3-6 meses Realizar pruebas específicas para VIH-2 en suero inicial más pruebas suplementarias (PCR) para el VIH-1 Un resultado indeterminado en el Western Blot conlleva desventajas tanto para el médico como para el paciente. Este debe ser interrogado sobre potenciales fuentes de exposición reciente al VIH. Una segunda muestra, recogida a los 3-6 meses debe ser de nuevo analizada por EIA y Western blot. Además, se recomienda realizar en el suero inicial pruebas específicas para el VIH-2 u otras pruebas suplementarias para el VIH-1, preferentemente por PCR.

VIH-1. Diagnóstico Pruebas de Confirmación indirectos
Line Immune Assay (LIA) Western Blot (WB) Tanto la prueba de Western Blot como el inmunoensayo en línea constituyen las pruebas de confirmación del diagnóstico de una infección por el VIH

VIH-1. Diagnóstico indirectos
Esta diapositiva esquematiza el proceso seguido en las pruebas de confirmación (WB y LIA) para la lectura del resultado del diagnóstico del VIH. La identificación por inmuno-ensayo en línea (LIA) de la glicoproteína gp36 es diagnóstica de infección por el VIH-2.

Características operacionales de las pruebas de detección de Ac frente al VIH
Sensibilidad: Es la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. Especificidad: Es la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. Valor predictivo positivo: Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un resultado positivo en el test. Valor predictivo negativo: Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba esté realmente sano.

Valor Predictivo Positivo Valor Predictivo Negativo
VIH-1. Diagnóstico Sensibilidad (>98%) Especificidad (98%) Valor Predictivo Positivo Valor Predictivo Negativo > Prevalencia > VPP y < VPN < Prevalencia < VPP y > VPN

VIH-1. Diagnóstico Primoinfección
Seguimiento. Acs. Basal – 3 meses – 6 meses CV > copias RNA-VIH-1/ml plasma Falsos (+) (4%) / Falsos (-) (var. Genética) Anticuerpos negativos o débilmente positivos Western Blot negativo o indeterminado Tras el contacto con el VIH se inicia un periodo "ventana" de 4 a 12 semanas que corresponde a la fase de primoinfección y durante el cual no es posible detectar la presencia de una respuesta humoral ni celular frente al VIH a pesar de existir niveles de viremia elevados. Por tanto, durante el periodo ventana al no haberse desarrollado ninguna respuesta humoral no son útiles los métodos diagnósticos basados en la detección de anticuerpos para el diagnóstico de infección, al diagnóstico sólo llegaríamos a través de la medida directa del material genético del virus en plasma (PCR). Tras este periodo ventana, se produce una respuesta inmune especifica frente al VIH por lo que se detectan tanto anticuerpos específicos como linfocitos CD8 con actividad citotóxica frente al VIH, ocurre por tanto la seroconversión, y con ello la posibilidad de diagnosticar la infección por el VIH mediante test de detección de anticuerpos. La detección del antígeno p24 del virus se encuentra limitada al diagnóstico en el período ventana en casos de presencia de signos clínicos sospechosos de primoinfección. RNA-VIH-1 NO ES DIAGNÓSTICO

Pruebas de Confirmación. Western Blot Criterios de Positividad
VIH-1. Diagnóstico indirectos Pruebas de Confirmación. Western Blot Criterios de Positividad OMS. 2 gp: gp160, gp120, gp41 CRA. 1 de cada gen estructural (env, pol y gag) FAD. P24 + p32 + (gp41 o gp120 o gp160) CRSS. P24 + (gp41 o gp120 o gp160) o p32 + (gp41 o gp120 o gp160) CDC. P24 + (gp41 o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160) En esta diapositiva se recogen los diferentes criterios de positividad de una prueba de Wstern Blot en función del organismo que los define (OMS, CDC, FDA, …).

VIH-1. Diagnóstico indirectos Algoritmo diagnóstico del VIH

Aspectos técnicos del diagnóstico de VIH

Presentaciones similares

Presentación del tema: "Aspectos técnicos del diagnóstico de VIH"— Transcripción de la presentación:

Presentaciones similares

Sobre el proyecto

Feedback

Iniciar la sesión

Autorizarse a través de una red social:

Aspectos técnicos del diagnóstico de VIH

Presentaciones similares

Presentación del tema: "Aspectos técnicos del diagnóstico de VIH"— Transcripción de la presentación:

Presentaciones similares

Sobre el proyecto

Feedback