CROMATOGRAFÍA DE GASES

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1 CROMATOGRAFÍA DE GASES
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 TEMA 18 CROMATOGRAFÍA DE GASES

2 CONTENIDOS Conceptos básicos Instrumentación
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 CONTENIDOS Conceptos básicos Instrumentación Aplicaciones al análisis de alimentos  

3 Método Técnica Fase estacionaria Fase móvil GAS PORTADOR
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Conceptos básicos Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio GC Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre gas y líquido Gas-sólido Sólido Adsorción REQUISITOS DE LAS ESPECIES BAJO ANÁLISIS ☺ Ser volátiles ☺ Ser térmicamente estables En cromatografía de gases la muestra vaporizada se inyecta en una fase móvil gaseosa para atravesar la fase estacionaria que se encuentra en el interior de una columna. De acuerdo con el tipo de fase estacionaria, se pueden diferenciar dos técnicas diferentes: En cromatografía gas-líquido (GLC), la fase estacionaria es un líquido adsorbido sobre un sólido, pudiendo esta adsorción darse sobre la pared interna de la columna o sobre un sólido soporte, en cualquier caso la separación de los componentes de la mezcla tiene lugar por equilibrios de distribución entre la fase gas y la fase líquida. En cromatografía gas-sólido (GSC), la fase estacionaria es un sólido y la separación de los componentes de la mezcla tiene lugar por equilibrios de adsorción física en la fase sólida. Los componentes a separar mediante cromatografía de gases han de ser volátiles y además térmicamente estables. Aquellas especies que no son volátiles o son térmicamente lábiles no se pueden analizar por GC de forma directa, en estos casos se utiliza cromatografía líquida. Como ventaja importante de GC cabe destacar que la transferencia de los analitos desde la columna al detector resulta muy eficiente y además la fase móvil aporta mínimas interferencias. Ahora bien, las características que han de presentar los analitos para ser analizados por GC puede resultar un inconveniente pues el campo de aplicación se centra principalmente en especies volátiles de carácter orgánico, las aplicaciones a especies inorgánicas se limitan a compuestos organometálicos volátiles. Finalmente, se ha de destacar el hecho de que en GC, al igual que en LC de exclusión, la fase móvil no presenta un papel activo en la separación, su función es simplemente la de arrastrar a los componentes de la muestra a través de la fase estacionaria, de ahí que nos refiramos a ella simplemente como gas portador o gas de arrastre. CAMPO DE APLICACIÓN LIMITADO A: Compuestos orgánicos volátiles Compuestos organometálicos volátiles Fase móvil GAS PORTADOR

4 COMPONENTES DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación COMPONENTES DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES Entrada de gas portador Septum de silicona Puerto de inyección Horno Columna Detector Ordenador Gas Portador Sistema de inyección Los componentes básicos de la instrumentación empleada en cromatografía de gases son: Gas portador Sistema de inyección de muestra Columna cromatográfica Horno para termostatización de la columna Detector Horno y columna Fig.1 Detector

5 GAS PORTADOR Debe ser químicamente inerte, puro (99,99%) y seco.
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación GAS PORTADOR Transporta los compuestos a través de la columna. Debe ser químicamente inerte, puro (99,99%) y seco. El más empleado es He. Aunque también se usan H2 y N2. Caudales comúnmente empleados: ► mL/min para columnas de relleno ► 0,5 - 4 mL/min para columnas capilares Fig.1 En GC la fase móvil es un gas químicamente inerte, aunque el más usado es el helio, también se emplean nitrógeno e hidrógeno. Estos gases se comercializan envasados en tanques a presión, con altos grados de pureza y libres de humedad. Como ya se ha mencionado con anterioridad, la única función del gas portador, como su nombre indica, es la de arrastrar a los componentes de la muestra a lo largo de la fase estacionaria, de modo que la separación tendrá lugar por la distinta afinidad que presenten hacia dicha fase. Los caudales habituales de trabajo, varían dependiendo del tipo de columna empleada: las columnas de relleno admiten caudales comprendidos entre 25 y 150 mL min-1, mientras que han de ser mucho menores para las columnas capilares, concretamente entre 0,5 y 4 mL min-1.

6 SISTEMA DE INYECCIÓN CON DIVISIÓN DE FLUJO SIN DIVISIÓN DE FLUJO
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación SISTEMA DE INYECCIÓN CON DIVISIÓN DE FLUJO Inyección Zona de evaporación de la muestra Pared metálica Camisa de vidrio silanizado Cámara de mezcla Punto de división Columna cromatográfica Regulador de presión Controlador de flujo Entrada de gas portador Venteo Hacia venteo Una fracción de la muestra inyectada va a residuos El sistema de inyección viene provisto de un septum de goma de silicona a través del que se inyecta la muestra, líquida o gaseosa, haciendo uso de una microjeringa que perfora dicho septum. La muestra si no se halla en fase vapor pasará a dicha fase en la zona de vaporización, que se calentará a una temperatura generalmente de unos 50 ºC por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra. El volumen de inyección ha de ser adecuado para que no se produzca excesivo ensanchamiento de las bandas cromatográficas; en columnas de relleno los volúmenes de muestra generalmente inyectados oscilan entre décimas de microlitro hasta unos 20 µL, mientras que si la columna es capilar los volúmenes suelen encontrarse en el intervalo de 0,001 a 2 µL. La diapositiva muestra un inyector de tubo de vidrio silanizado. La fase móvil arrastra la muestra en fase vapor desde el inyector a la columna. Se requieren distintos tipos de inyección según el tipo de muestra. Si los analitos a determinar se hallan en la muestra a una concentración superior al 0,1%, se prefiere la inyección con división de flujo. Si por el contrario, los analitos se hallan en la muestra a niveles traza, concentraciones inferiores al 0,01%, se utiliza el modo de inyección sin división de flujo. Fig.1 SIN DIVISIÓN DE FLUJO El volumen total inyectado va a la columna. El tubo de vidrio no tiene cámara de mezcla

7 INYECCIÓN CON DIVISIÓN DE FLUJO INYECCIÓN SIN DIVISIÓN DE FLUJO
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación INYECCIÓN CON DIVISIÓN DE FLUJO INYECCIÓN SIN DIVISIÓN DE FLUJO Disolvente Disolvente Obsérvese la diferente resolución obtenida al inyectar un determinado volumen de muestra con y sin división de flujo en una columna capilar. Para determinadas muestras, la división del flujo es necesaria para conseguir cromatogramas con adecuados parámetros de separación. Fig.1 Tiempo, min

8 COLUMNAS TIPOS: - Columnas de relleno - Columnas capilares
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación TIPOS: - Columnas de relleno - Columnas capilares COLUMNAS L de 10 a 75 m Pared externa de la columna D.I. 0,1 – 0,53 mm Gas portador Fig.1 Fig.2 Fase estacionaria 0,1 – 5 µm espesor Pared de la columna Fase estacionaria líquida Sólido soporte recubierto con la fase estacionaria sólida En la columna cromatográfica tiene lugar la separación de los componentes de la muestra. Aunque existen dos tipos de columnas, las de relleno o empaquetadas y las capilares, nos centraremos en las columnas capilares por ser con una gran diferencia las más empleadas actualmente en GC ya que proporcionan mejores eficacias de separación. Las columnas capilares generalmente se fabrican de vidrio o sílice fundida con longitudes comprendidas entre 10 y 75 m y diámetros internos de 0,1 a 0,53 mm. Debido a sus dimensiones estas columnas vienen enrolladas en espiral con el fin de poder ser cómodamente introducidas en el horno. La fase estacionaria presenta un espesor de 0,1 a 5 µm, bien se trate de líquido directamente adherido a las paredes internas de la columna, un líquido recubriendo la superficie externa de un soporte sólido, o de un sólido. Fig.3

9 FASES ESTACIONARIAS Estructura Polaridad Intervalo de temperatura, ºC
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación Estructura Polaridad Intervalo de temperatura, ºC FASES ESTACIONARIAS No polar No polar Polaridad intermedia Polaridad intermedia (Difenil)x(dimetil)1-x polisiloxano Polaridad intermedia (Cianopropilfenil)0.14(dimetil)0.86 polisiloxano La tabla de la diapositiva muestra las fases estacionarias más comunes para columnas capilares, detallando sus estructuras, polaridad y el intervalo de temperaturas recomendado para su uso. La selección de la fase estacionaria tendrá en consideración la polaridad de los analitos bajo estudio. Polaridad muy alta Carbowax (poli(etilen glicol)) Polaridad muy alta Fig.1 (Biscianopropil)0.9(cianopropilfenil)0.1 polisiloxano

10 Separación de 16 hidrocarburos (C5-C21)
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación Fig.1 HORNO Control T de la columna = alta repetitividad en los tR Separación de 16 hidrocarburos (C5-C21) Separación isoterma a 150 ºC Para conseguir tiempos de retención reproducibles, es necesario controlar la temperatura de la columna dentro de unas pocas décimas de grado. Para ello se coloca la columna dentro de un horno, tal y como se representa en la fotografía de la diapositiva. La temperatura a la que se programe la columna para llevar a cabo la separación depende del punto de ebullición de los componentes de la mezcla a separar. Una T igual a la del valor medio de los puntos de ebullición de los componentes, resulta lo más adecuado si el intervalo de valores de dichos puntos de ebullición no es muy amplio. Sin embargo, si el grupo de compuestos a separar abarca un intervalo muy amplio de valores para sus temperaturas de ebullición, la mejor solución es aplicar un programa de temperatura. Véase como ejemplo la separación de 16 hidrocarburos llevada a cabo a temperatura constante (150 ºC), como puede apreciarse en el cromatograma obtenido, los tres hidrocarburos más volátiles eluyen antes que el disolvente, mientras que los seis hidrocarburos menos volátiles, tras 95 min todavía permanecen retenidos en la fase estacionaria. C5, C6 y C7 eluyen antes que el disolvente Respuesta del detector Tras 95 min, C16 a C21 todavía no han eluído Tiempo, min Fig.2

11 PROGRAMA DE TEMPERATURA
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación Respuesta del detector Tiempo, min PROGRAMA DE TEMPERATURA 50 – 250 ºC a 8 ºC/min Dado que las temperaturas de ebullición de los 16 hidrocarburos bajo análisis abarcan un intervalo muy amplio, si se mantiene la temperatura constante en la columna la separación no es buena. Sin embargo, al programar un aumento de temperatura, va aumentando la presión de vapor de los analitos y eluyen más rápidamente. De hecho, un programa adecuado como el presentado en la figura donde la temperatura aumenta de forma lineal, se consigue la separación de todos en un tiempo razonable y con una resolución óptima. Fig.1 Los 16 hidrocarburos son eluídos en menos de 40 min con alta resolución

12 2. Instrumentación Fig.2 Fig.1 Asignatura: Análisis Químico
Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación Fig.1 Fig.2 La figura 1 de la diapositiva muestra un cromatógrafo de gases con la puerta del horno cerrada, mientras que en la figura 2 aparece abierta dicha puerta, pudiendo apreciar la columna capilar en su interior.

13 Factores que afectan la eficiencia de una columna capilar
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación Factores que afectan la eficiencia de una columna capilar Naturaleza de la fase estacionaria Dimensiones de la columna (Longitud, diámetro y espesor de fase estacionaria). Temperatura de la columna Velocidad del gas portador Cantidad de muestra inyectada Antes pasar a explicar los principales detectores empleados en GC, veamos cuales son los principales factores que determinan la eficiencia de una columna capilar: En cuanto a la columna, lo más determinante es la naturaleza de la fase estacionaria, aunque también es importante considerar sus dimensiones (longitud y diámetro) así como el espesor de la película de fase estacionaria. La separación de compuestos muy polares requiere una fase estacionaria de alta polaridad, si los compuestos a separar son apolares se elegirá una fase estacionaria de carácter apolar. Para conseguir la máxima resolución de los picos cromatográficos se requieren columnas de pequeño diámetro interno y con espesores de fase estacionaria bajos. De este modo, se minimiza la resistencia a la transferencia de masa tanto en la fase móvil como en la estacionaria, disminuyendo la altura equivalente de plato teórico. Las columnas estrecha y de alto espesor de película se usan cuando se requiere un compromiso entre resolución y capacidad de muestra, en este caso los tiempos de retención son mayores que con espesores de película finos. La temperatura que se programe en el horno también es determinante. Finalmente tanto la velocidad de la fase móvil como el volumen de muestra inyectada afectarán a la resolución de los picos cromatográficos. En cuanto a este último factor, ya se indicó con anterioridad que si la concentración de los analitos es alta se prefiere el modo de inyección con división de flujo; sin embargo, si las disoluciones de muestra son diluidas se prefiere la inyección sin división de flujo.

14 DETECTOR Requisitos de un detector ideal para GC:
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación DETECTOR Requisitos de un detector ideal para GC: Adecuada sensibilidad para los analitos Buena estabilidad y reproducibilidad Respuesta lineal en varios órdenes de magnitud Intervalo de T de trabajo de 25 – 400 °C Tiempo de respuesta corto e independiente del caudal de fase móvil Manejo sencillo No destructivo Necesarios Deseables Un detector ideal para cromatografía de gases debe presentar las siguientes características o propiedades: Sensibilidad adecuada para los compuestos bajo análisis. Buena estabilidad y reproducibilidad. Presentar un intervalo de linealidad de varios órdenes de magnitud. Debe ser capaz de trabajar a cualquier temperatura comprendida entre ambiente y 400 ºC. Ha de presentar una respuesta rápida e independiente del caudal de fase móvil Ser fácil de manejar No destruir la muestra. Por desgracia, no existe ningún detector que cumpla al mismo tiempo todas las características citadas. A continuación, vamos a explicar el fundamente de algunos de los detectores más empleados para GC. No existe ningún detector que cumpla simultáneamente todas estas características

15 FID DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA Destructivo Alta sensibilidad
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA FID Fig.1 Destructivo Cátodo (colector de iones CHO+) Alta sensibilidad Ánodo (soporte de la llama) Ionización de las moléculas orgánicas: Bovina de ignición CH + O → CHO+ + e- En el detector de ionización en llama, el efluente de la columna pasa a través de una llama, del tipo aire:hidrógeno, quemándose, de modo que los átomos de carbono (salvo los de carbonilos y carboxilos) producen radicales CH, que según la reacción de la diapositiva se ionizan produciendo CHO+. La diferencia de potencial establecida entre un cátodo (placa metálica situada por encima de la llama) y un ánodo (que es el quemador donde se forma la llama) provoca que los cationes (CHO+), producidos a partir de los compuestos orgánicos, migren hacia el cátodo, provocando una señal eléctrica. Este detector responde a la mayoría de los hidrocaburos. Aislante de vidrio Difusor de aire Entrada de aire Flujo de gas desde la columna Entrada de hidrógeno

16 TCD DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA Conexiones eléctricas a
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA TCD Conexiones eléctricas a la fuente de alimentación y al circuito exterior No destructivo Salida del flujo de gas Bloque Flujo de gas El funcionamiento del detector de conductividad térmica se basa en las variaciones de la conductividad del flujo de gas efluyente de la columna por la presencia de los compuestos eluidos. El filamento es calentado eléctricamente por una fuente de potencia externa y la temperatura que alcanza depende de la conductividad del gas en contacto con él. La conductividad de la fase móvil es elevada, disminuyendo cuando contiene compuestos orgánicos, de modo que cuando los analitos son eluidos aumenta la temperatura del filamento. Una desventaja de este detector es que responde a todos los compuestos eluidos de la columna y además que su sensibilidad no es muy alta. desde la columna Filamento (Au, Pt ó W) Fig.1

17 Alta sensibilidad y sensibilidad para
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES ECD Aislante Emisor de partículas β No destructivo Flujo de gas desde la columna Cuando se emplea el detector de captura de electrones se hace impactar el efluente de la columna contra una sustancia emisora de partículas β (electrones) que suele ser 63Ni adsorbido sobre una placa de platino o titanio. Las partículas β ionizan la fase móvil produciendo una ráfaga de electrones, que dan lugar a una intensidad de corriente constante entre dos electrodos. Sin embargo, cuando la fase móvil contiene sustancias con tendencia a captar electrones, la intensidad de corriente entre los electrodos disminuye. Este detector es muy selectivo y sensible para compuestos químicos que contienen en sus moléculas grupos electronegativos. Alta sensibilidad y sensibilidad para compuestos con grupos electronegativos Electrodo + Electrodo -

18 MS DETECTOR DE MASAS Destructivo Sistema de adquisición de datos
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación DETECTOR DE MASAS MS Destructivo Sistema de adquisición de datos Flujo de gas Multiplicador de electrones: Detector Cámara de ionización Analizador desde la columna Sistema de alto vacío Sin duda, la espectrometría de masas es el mejor detector para GC, aunque por desgracia también el más caro. Proporciona información tanto cualitativa como cuantitativa, y trabajando en los modos de detección de iones seleccionados o detección de una reacción seleccionada, es posible la cuantificación de un analito en un cromatograma muy complejo de compuestos poco resueltos. ALTA SELECTIVIDAD: - Detección de iones seleccionadas - Detección de una reacción seleccionada

19 Conductividad térmica 400 pg/mL (propano) > 105 No destructivo
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Instrumentación Detector Límite de detección Intervalo lineal Tratamiento soluto Ionización en llama 2 pg/s > 107 Destructivo Conductividad térmica 400 pg/mL (propano) > 105 No destructivo Captura de electrones 5 fg/s 104 Espectrómetro de masas 25 fg a 100 pg 105 Fotometría de llama < 1 pg/s (P) < 10 pg/s (S) > 104 > 103 Nitrógeno-fósforo 100 fg/s La tabla muestra los límites de detección aproximados así como la amplitud de sus intervalos lineales para los detectores más empleados en GC. Obsérvese la extremada sensibilidad del ECD, sin embargo recordemos que se trata de un detector muy selectivo. Mas alta todavía es la selectividad de los detectores de fotometría de llama y nitrógeno-fósforo que solamente son aplicables para sustancias conteniendo P ó S y N ó P, respectivamente.

20 GC-AED chromatogram obtained from soil 4 previously fortified
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Aplicaciones al análisis de alimentos Determinación de pesticidas Determinación de VOCs, halofenoles, haloanisoles Determinación de PAHs Determinación de PCBs Determinación de compuestos organometálicos (As, Se, Mn, Sn…) …… Mediante cromatografía de gases se han encontrado aplicaciones al análisis de alimentos para determinación de gran variedad de compuestos, de los que merece la pena destacar aromas, pesticidas, compuestos orgánicos volátiles halogenados, hidrocarburos aromáticos policíclicos, bifenilos policlorados o compuestos organometálicos. Al comienzo del tema se indicó la necesidad de que los compuestos a separar mediante GC fuesen volátiles y térmicamente estables; sin embargo, es importante resaltar que existen numerosos procedimientos para análisis de compuestos no volátiles mediante GC habiendo sido sometidos éstos previamente a una reacción química para transformarlos en derivados volátiles. ¿y si mis analitos no son volátiles? Uso reacciones de derivatización GC-AED chromatogram obtained from soil 4 previously fortified 1. Chlorpropham (55 ng/g); 2, lindane (15 ng/g); 3, diazinon (19 ng/g); 4, chlorpyriphos (30 ng/g); 5, a-endosulfan (15 ng/g); 6, p,p´-DDE (20 ng/g); 7, p,p´-DDD (20 ng/g); 8, p,p´-DDT (20 ng/g); 9, permethrin (45 ng/g) and 10, deltamethrin (60 ng/g)

21 CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS Logo encabezado de páginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: Página 4, Fig.1. Fuente: Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Sixth Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. Página 5, Fig.1. Fuente: Autor: William Viker. Páginas 6 y 7, Fig.1. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Sixth Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company Página 7, Fig.1. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Sixth Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. Página 8, Fig.1, Fig.2 y Fig.3. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Sixth Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. Páginas 9 y 11, Fig.1. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Sixth Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. Página 10, Fig.1. Fuente: Autor: Jmave, rcvanwijk Página 10, Fig. 2. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Sixth Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. Página 12, Fig.1. Fuente: Autor: Original uploader was Dubaj at sk.wikipedia Página 12, Fig.2. Fuente: Páginas 15 y 16, Fig.1. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Sixth Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company