VACUNA VIVA ATENUADA CONTRA EL COLERA. Desarrollo de la Vacuna viva liofilizada contra cólera de la cepa atenuada 638 Obtención de una cepa atenuada de.

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1 VACUNA VIVA ATENUADA CONTRA EL COLERA

2 Desarrollo de la Vacuna viva liofilizada contra cólera de la cepa atenuada 638 Obtención de una cepa atenuada de Vibrio cholerae O1 El Tor Ogawa. Evaluación en voluntarios sanos Desarrollo Tecnológico Producción y liberación de lotes de vacunas Estudios preclínicosEstudios de estabilidad Diseño y conducción de ensayos clínicos

3 Boris L. Rodríguez González, Ph. D. Departamento de Genética, CNIC. OBTENCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE CEPAS VIVAS ATENUADAS DE Vibrio cholerae

4 4. Enfermedad diarrea + vómitos acidosis dolores musculares choque hipovolémico El cólera 3. Coloniza (produce enterotoxina) 1. Vía entrada 5. Excreción (  1 L/día) 2. Vence inm. natural

5 1. Vacuna contra el cólera El Tor inexistente. 2. Protección en convalescientes  3 años. 3. Toxina colérica requisito para el cólera gravis. 4. Immunidad antibacteriana protectora. 5. Inmunidad antitoxina superflua. 6. Desconocimiento de la combinación de Ag Protectores. 7. Vacunas muertas: EP = 60% (exc niños), 2 - 3 dosis. Racionalidad vacunas vivas de cólera

6 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 1 Deleción del profago CTX Φ Cepas patógenas de V. cholerae V cholerae C7258 El Tor Ogawa V cholerae C6706 El Tor Inaba Genes de CTX Φ E.coli SM10 pir (donante 1) Conjugación Pases y Selección Estrategia

7 Remoción de CTX . Eventos moleculares C6706 C7258 C67 8 C67 4 C72 8 C67 1 C67 3 C72 3 4 13 4 17 8 1 8 2 8 4 8 78 Kb A B C D E 23,1 9,4 6,5 4,3 2,3 LBPA: C67 (1...10) C72 (1...10) 10 pases en LB 1000 colonias Amp sensibles= 70 LBP y LBPA PC1C2S1 No. 2 No. 1 SONDAS

8 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 2 Inserción del gen celA en el gen de la hemaglutinina proteasa Cepas de generación 1 de V. cholerae Cepas de Generación 1 8 1 y 4 13 E.coli SM10 pir (donante 2) Hemaglutinina proteasa Conjugación Pases y Selección cel A Estrategia

9 Obtención de CGM de V. cholerae por reemplazamiento hap por hap::celA 8 1 4 13 6 1,4,9,10 6 3 13 1...10 6 31 6 38 133 2 133 3 Kb A B D E 23,1 6,5 4,3 2,3 LBPA: 6 (1...10) 13 (1...10) 10 pases en LB Amp sensibles= 21 PC1S1 1000 colonias LBP y LBPA No. 4No. 3 SONDAS 9,4

10 Niveles de toxina colérica en las cepas progenitoras y modificadas

11 Detección de la hemaglutinina proteasa (Hap) en las cepas progenitoras y genéticamente modificadas Carriles 1: C7258 2: 8 1 3: 63 1 4: 63 8 5:C6706 6:4 13 7:133 3 La detección de Hap fue realizada con una preparación de anticuerpo policlonal anti-Hap obtenido en conejo. (Anticuerpo donado por el Dr. Richard Finkelstein) Ensayo de ‘Western blot’

12 Detección de la actividad celulolítica de las cepas vacunales de V. cholerae de generación 1 y 2 A: Western blot con anticuerpos policlonales anti Cel A obtenidos en conejo: Carriles: 1(413); 2 (1333), 3 (81); 4 (631; 5 (638) B: Actividad celulolítica de las cepas vacunales en geles de poliacrilamida (geles de Beguin) C: Actividad celulolítica de la cepa 638 en placa petri C

13 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA DETERMINAR LA DOSIS DE TRABAJO CON LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2 9 grupos de ratones balb/c lactantes fueron inoculados con las cepas de V. cholerae que se indican y a las dosis señaladas Cepa C6706 Cepa C7258 10 3 10 4 10 5 N = 12 N = 81 N = 90 N = 39 N =113 Inóculo Vehículo N = 39 Controles Se deteminó la sobevivencia de los animales en los grupos y se compararon entre si. Se empleó el método de log Rank

14 Selección de la dosis de trabajo Conclusión La dosis 10 5 UFC de C6706 o C7258: 100 x dosis letal 100%

15 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EVALUAR LA VIRULENCIA Y LA CAPACIDAD DE COLONIZACIÓN DE LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2 Subgrupo 1: Se determina la sobrevivencia Subgrupo 2: Se determina la capacidad de colonización del intestino delgado UFC/cm 2 Se inoculan los ratones Balb/c lactantes con la dosis de trabajo (10 5 UFC) Se divide cada grupo en dos subgrupos Diseño GRUPOS Cepa 4 13 Cepa 133 3 Cepa 8 1 Cepa 63 1 N = 75/grupo Cepa 63 8

16 Virulencia y colonización de las CGM (Dosis 105) -Panel superior: Virulencia. Gráfico de Kaplan-Meier -Panel inferior: Colonización en intestino delgado

17 CEPAS Log UFC/mL 1 -Log UFC/mL 2 F1 3 F9 4 6380.760.64 CVD103-HGR0.860.71 Efecto de dos formulaciones sobre la viabilidad de dos cepas liofilizadas 1 Log UFC/mL antes del proceso de liofilización. 2 Log UFC/mL después del proceso de liofilización. 3 Formulación compuesta por: lactosa, peptona bacteriológica y sorbitol. 4 Formulación compuesta por: leche descremada, peptona bacteriológica y sorbitol.

18 PERDIDA DE VIABILIDAD DE LA CEPA 638 EN DOS FORMULACIONES Y EN DIFERENTES TIEMPOS

19 AcM IsotipoEspecificidadUtilidad 1G10G5 IgG2a CT-A, reacciona con CT-1 (toxina de V. cholerae O1, clásica) y CT-2 (toxina de V. cholerae O1, El Tor). GM-1 ELISA Western Blot 4D1G5 IgG2a CT-B, REACCIONA CON CT-1 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, CLÁSICA) Y CT-2 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, EL TOR). GM-1 ELISA Western Blot 2F12F1 IgG3 MSHA de cepas de V. cholerae O1 y O139.ELISA Wester Blot 10E10E1 IgG2a TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (BIOTIPOS CLÁSICO Y EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. ELISA Wester Blot 4D6F9 IgG1 TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (SOLAMENTE BIOTIPO EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. ELISA Wester Blot 6G1E12F1 IgG3 LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139. ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida 4D2G5 IGg2b LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 ELISA, Wester, y Vibriocida 2B4 IgG1 LPS de cepas de V. cholerae O1 (solamente serotipo Ogawa), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida 9A11D6 IgG1 LPS de cepas de V. cholerae O139, no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O1 ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida Anticuerpos Monoclonales y Métodos de Detección

20 PATENTE CONCEDIDA

21

22 ENSAYOS CLÍNICOS EN VOLUNTARIOS SANOS CON INÓCULO FRESCO DE LA CEPA ATENUADA 638 DE Vibrio cholerae Luis García Imías Ph. D. Dirección de Vacunas Bacterianas. www.finlay.sld.cu lgarcia@finlay.edu.cu Habana, Cuba.

23 Demostrar el potencial de la cepa 638 como cepa vacunal contra el cólera. Objetivo Voluntarios sanos de 18 a 40 años hospitalizados en la Sala de Aislamiento Clínico del IPK. Estudios a doble ciego (vacuna-placebo) con 18 voluntarios por ciclo. Una sola dosis administrada por vía oral. Dos semanas de seguimiento en la sala de aislamiento. Tratamiento con antibiótico antes de abandonar la sala. Diseño

24 EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA CEPA 638 Estudios de reactogenicidad e inmunogenicidad en voluntarios VacunadosPlacebosTotalPaís 7746123Cuba 261945Ecuador 10365168Total

25 REACCIONES ADVERSAS LUEGO DE LA INGESTIÓN DE LA CEPA VACUNAL 638 Los efectos adversos inducidos por la cepa 638 fueron leves y de escasa duración. Se presentaron 4 casos con diarrea reactogénica entre los vacunados (8%) y un caso en el grupo placebo, en los estudios realizados en Cuba. En los estudios realizados en Ecuador no se presentó diarrea entre los vacunados mientras ocurrió en un voluntario placebo. La sintomatología presentada no interfiere con las actividades normales del vacunado. Tanto en la diarrea como en el resto de los síntomas no se encontraron diferencias significativas entre el grupo vacunado y el placebo.

26 RESULTADOS DE INMUNOGENICIDAD

27 Ensayo de eficacia protectora del candidato vacunal Dr. Manuel Díaz Jidy Subdirector del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” jidy@infomed.sld.cu Habana, Cuba.

28 Primera vez que se realiza en Cuba. Hacerlo directamente en humanos. Producir un infección experimental potencialmente mortal en voluntarios. No existe la enfermedad en el país. Antecedentes

29 1.Garantizar la salud de los voluntarios participantes. 2.Valorar la eficacia protectora de la cepa 638. 3.Evaluar la reactogenicidad e inmunogenicidad. 4.Impedir escape al medio ambiente del producto vacunal y/o la cepa viva virulenta con que se retó. Objetivos

30 DISEÑO DEL ESTUDIO DE RETO 21Voluntarios 18 - 40años 12voluntarios9 1-9 x 10 9 UFCcepa Placebo Cepa dereto 3008 10 6 UFC (12 V and 9 P) EFICACIA PROTECTORA Un mes después Un mes después Seguimiento síntomas clínicos durante 5 días

31 Resultados La cepa 638 resultó segura, no reactogénica e inmunogénica. No se evidenciaron escapes de la vacuna, ni de la cepa virulenta al medio ambiente. Incidencia de diarrea después de la administración de la cepa del reto Grupo 1 (vacunados) N=12 Grupo 2 (placebo) N=9 7 (77.7 %)0 (0.00 %) La cepa 638 mostró una eficacia protectora del 100 %.

32 Impacto Científico Este estudio constituyó la prueba indispensable para determinar la selección de la cepa atenuada 638 como ingrediente farmacéutico activo dentro de la vacuna contra el cólera, del serotipo y biotipo de mayor interés epidemiológico en el mundo. Estos ensayos prestigian la capacidad de Cuba en la validación de vacunas y nos permite continuar investigaciones cada vez más complejas.

33 DESARROLLO TECNOLÓGICO FARMACÉUTICO DE LA VACUNA VIVA ATENUADA CONTRA EL CÓLERA Lic. Yilian Plasencia Gerencia de Proyectos. www.finlay.sld.cu yplasencia@finlay.edu.cu Habana, Cuba.

34 Transferencia de Investigación a Desarrollo Desarrollo de una tecnología de obtención a escala piloto del preparado vacunal Optimización de los parámetros de cultivo Microbiología Fermentación Medios de cultivo de diferentes proveedores Tiempos de esterilización Velocidades de agitación Volúmenes de cultivo Aireación superficial sumergida Flujos de aire Desarrollo Farmacéutico

35 Selección del método de separación celular Centrifugación Filtración tangencial Establecimiento de una tecnología de liofilización Selección de lioprotectores Parámetros de liofilización Establecimiento de una tecnología de producción Adecuación del área y obtención de la licencia de producción del CNSB

36 Definición del desarrollo analítico (control de calidad) Batería de caracterización Ensayos de liberación de lotes Otros estudios Preclínica Consistencia Estabilidad Producción y liberación de lotes de vacuna Inmunogenicidad Toxicidad Colonización Inmuogenicidad Pureza Identidad Seguridad Viabilidad

37 Obtención del antiácido Inocuidad frente a Vibrio cholerae Evaluación capacidad tampón Evaluación de su disolución Estudio de estabilidad Confección del protocolo del ensayo clínico Diseño y conducción de un ensayo clínico fase I – II en Cuba Elaboración de la documentación Tramitación de solicitud de autorización para el inicio de los ensayos clínicos

38 Vacuna viva atenuada contra cólera Capacidad productiva Dos procesos semanales de 10L, con un rendimiento de 1192 dosis Presentación Forma farmacéutica Vía de administración Producto liofilizado. Es una vacuna de células enteras de Vibrio cholerae que se reconstituye con un antiácido en 100 mL de agua natural, lista para su uso inmediato Oral Bulbo conteniendo una dosis Estuche conteniendo el antiácido Vaso conteniendo 100mL de agua natural

39 Fin