Tecnología en Bioquímica y Biología Molecular. 4º Biología. Curso 2011-2012 José María Pérez Freije Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, 4.15 Tel. 985 10 6281 jmpf@uniovi.es http://degradome.uniovi.es/jmpf/TBBM

Homogeneización de muestras biológicas Obtener biomoléculas en forma soluble Disgregar tejidos Lisar células

Homogeneización de muestras biológicas Procedimientos mecánicos Métodos químicos (detergentes, agentes caotrópicos) Métodos enzimáticos

Homogeneización de muestras biológicas Elección del método de homogeneización Material biológico de partida. Naturaleza y cantidad Biomolécula a analizar o purificar. Sensibilidad a degradación enzimática, oxidación, etc- Finalidad. Necesidad o no de preservar la estructura y/o función de orgánulos o de la propia biomolécula Control de la temperatura

Métodos mecánicos de homogeneización Molienda con partículas de vidrio Pulverización de tejidos congelados Homogeneizadores de émbolo y tubo Homogeneizadores rotor/estator Presurización/despresurización Nebulización Ultrasonidos

Molienda con partículas de vidrio Rotura basada en el impacto con bolas (vidrio, acero, cerámica) Impacto Tensión de cizalla Cambios de presión Necesidad de controlar la temperatura Aplicaciones frecuentes: rotura de microorganismos (bacterias, levaduras, esporas) Formatos: agitación del recipiente (manual o automática) agitación interna

Molienda con partículas de vidrio Trituradores con agitación interna Escala preparativa Sistemas refrigerados Aplicaciones frecuentes: rotura de microorganismos (bacterias, levaduras, esporas) Triturador Dyno-Mill

Pulverización de muestras congeladas La utilización de morteros permite triturar tejidos congelados hasta pulverizarlos completamente. La homogeneización con nitrógeno líquido (-196 ºC) impide la degradación y desnaturalización de las biomoléculas Muy útil para obtener RNA de tejidos ricos en nucleasas o difíciles de homogeneizar Morteros convencionales de cerámica, morteros especiales de acero

Homogeneizadores de émbolo y tubo Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado. Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales frágiles como cerebro e hígado. No es eficiente en la fragmentación de microorganismos. Preferido en preparación de orgánulos subcelulares Acciónvsuave. Permite un buen control de la temperatura generada por la fricción.

Homogeneizadores de émbolo y tubo vidrio (hueco) / vidrio (Tenbroeck) Teflón / vidrio (Potter Elvehjem) vidrio / vidrio (Dounce)

Teflón / vidrio (Potter Elvehjem) Homogeneizadores de émbolo y tubo Teflón / vidrio (Potter Elvehjem)

Homogeneizadores rotor/estator (“politrón”) Disrupted cells Cell suspension Stator Consisten en un rotor que gira a alta velocidad en el interior de un tubo perforado que permanece fijo (estator) Homogenización rápida (10-60 s) y completa. Mecanismo de turbulencia ligera. Protección de organelos: menor velocidad y tiempo de exposición. Uso: tejidos animales y vegetales. Extracción de RNA.

Presurización/despresurización French Press Presurización/despresurización Inventada por Stacy French Se usa para romper bacterias y levaduras La suspensión de microorganismos se introduce en la célula de presión (cilindro de acero) y se aplica presión mediante un émbolo y una prensa hidráulica Los microorganismos estallan debido al cambio de presión que experimentan al abrir una válvula

Sonicación Aplica ultrasonidos a suspensiones celulares Cavitación. Volúmenes variables (0.1 ml – 500 ml) Microorganismos, células eucariotas Fragmenta ácidos nucleicos, disminuye la viscosidad Genera cantidades importantes de calor

Métodos mecánicos de homogeneización

Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular Tampón Sal, sacarosa Detergentes Agentes desnaturalizantes (urea, guanidinio) Inhibidores de proteasas Inhibidores de nucleasas Inhibidores de fosfatasas Agentes reductores

Detergentes Moléculas anfipáticas: Grupos polares y apolares Grupos polares: puentes de hidrógeno con agua Grupos apolares: agregan por interacciones hidrofóbicas Concentración micelar crítica (CMC): concentración a partir de la cual se forman micelas. Detergentes = surfactantes (disminuyen la tensión superficial del agua

Detergentes Tampón

Detergentes Detergentes iónicos (aniónicos, catiónicos) Sales biliares Detergentes no iónicos Detergentes zwiteriónicos (CHAPS, ZWITTERGENT® 3-X) partir de la cual se forman micelas.

SDS: Dodecil sulfato sódico, lauril sulfato sódico

Detergentes Detergentes iónicos (aniónicos, catiónicos) Sales biliares Detergentes no iónicos Detergentes zwiteriónicos (CHAPS, ZWITTERGENT® 3-X)

Agentes desnaturalizantes Ácidos, compuestos alcalinos Compuestos caotrópicos Urea Cloruro de guanidinio Solventes orgánicos (etanol, metanol, acetonitrilo, etc.) Compuestos reductores (DTT, 2-mercaptoetanol)

Lisis ezimática Bacterias: lisozima (N-acetylmuramide glycanhydrolase) Levaduras: Zymolyase (Lyticase) Tejidos animales: Proteasas (colagenasa, dispasa, tripsina) Enzimas degradativos: proteasas, DNasas, RNasas

Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular Tampón RIPA (“Radio-Immunoprecipitation Assay”): lisado de cultivos celulares · Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 · NP-40: 1% · Na-deoxycholate: 0.25% · NaCl: 150 mM · EDTA: 1 mM · PMSF: 1 mM · Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 µg/ml each · Na3VO4: 1 mM · NaF: 1 mM

Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular Tampón GIT (extracción de RNA) * 4 M Guanidine thiocyanate * 25 mM Sodium Citrate * 0.5% Sarkosyl * 0.1 M Beta-Mercaptoethanol

Tampones para homogeneización de tejidos y lisis celular Tampón “A” (lisis enzimática de bacterias) 50 mM Tris pH 7.9 50 mM Glucosa 1 mM EDTA

Lisis enzimática de bacterias Centrifugar 10 min a 5000 rpm Tirar el SN, escurrir el tubo boca abajo sobre un papel. Resuspender el pellet con 50 ml de Buffer A. Tirar el SN, escurrir el tubo boca abajo sobre un papel. Resuspender el pellet con 10 ml de Buffer A. Pasar 1.5 ml a un tubo eppendorf de 2 ml. Guardar el resto congelado a -20ºC. Añadir 15 microlitros de lisozima (stock 100 mg/ml). Dejar 15 min a temperatura ambiente, volteando de vez en cuando. Congelar con hielo seco o Etanol frío a -80 ºC. Descongelar a 75 ºC. Congelar y descongelar de nuevo. Pasar a hielo. Centrifugar 20 minutos a 12.000 rpm a 4 ºC. Recoger el sobrenadante