Compactación del DNA y Jerarquías Organizacionales CA García Sepúlveda MD PhD Laboratorio de Genómica Viral y Humana Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Compactación y jerarquias organizacionales Los cromosomas bacterianos circulares se compactan con poliaminas (como la espermina) las cuales se unen a las cargas negativas del DNA para neutralizar su carga y evitar la repulsión con el objeto de permitir la formación de madejas. El problema se agrava cuando se contempla que el ser humano posee 3 mil millones de pares de bases...pero no somos los más “grandes” La salamandra común...poseee 4x más DNA que nosotros. Incluso algunas plantas poseen más DNA que nosotros. Paradoja del valor C...el tamaño del genoma no es directamente proporcional a la complejidad del organismo. +

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Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Compactación y jerarquias organizacionales El DNA (ca 2 mts de largo) se almacena en el núcleo de las células eucariótas. El diámetro del núcleo celular fluctúa entre 5 y 10 m. El contorno de los cromosomas mide entre 1.6 y 8.2 cm. Compactación cromosómica human altamente eficiente: Condensación de 100,000 X

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Compactación y jerarquias organizacionales

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Supercoiling (super-embobinado) Es crítico para compactación del DNA. Especialmente util durante eventos de división nuclear. Las cohesinas y condensinas (Proteinas de mantenimiento estructural de los cromosomas) la inducen para condensar las cromátides. Resulta de la apertura del duplex de DNA durante la síntesis de DNA/RNA para darle acceso a la polimerasa (girasa, una topoisomerasa tipo II).

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Supercoiling (super-embobinado) Plectonémica Solenoide Superbobina

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Supercoiling (super-embobinado) En procariotas la plectonémica es suficiente para su pequeño genoma circular. Eucariotas emplean diversos grados de ambos tipos (pero la solenoidal es más eficiente). La solenoide reduce el espacio ocupado por DNA acoplado a histonas a través de giros que lo compactan en fibras de 10 y 30 nm. Compactación plectonémica: Bobinas extendidas con sentido horario. Se observa en DNA in vitro. Compactación Toroidal (solenoidal): Giros anti-horarios muy apretados DNA in vivo Más compacto que la plectonémica.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Supercoiling (super-embobinado) Duplex relajado, una vuelta sobre su eje cada 10 bp. Una molécula de DNA circular (como en las bacterias) puede ser sometida a torceduras que la obliguen a ocupar menos espacio...DNA-B Figura 8 = super-embobinado (plectonémico) elemental. Lóbulos de figura 8 exhibirán rotación horaria o antihoraria (sobreembobinado o infraembobinado). Superembobinado Relajado Compactación en levaduras

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Supercoiling (super-embobinado) Topoisomerasas generan o relajan el super-embobinamiento. La Topoisomerasa II eucariota no puede introducir giros negativos. El super-embobinado positivo es deseable por que: 1.- Reduce la posibilidad de interacciones con proteínas (hendidura M y m). 2.- Reduce el espacio físico ocupado por el DNA.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosomas Estructura propuesta por Roger Kornberg (1974). Premio Nobel Quimica 2006 “base molecular de la transcripción de DNA hacia RNA” Cromatosoma = Nucleosoma + proteina espaciadora. Nucleosoma posee coro de histonas (octámero) y ca 146 bp DNA. Compactación: 7x

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosomas Hijo de Arthur Kornberg Premio Nobel Medicina o Fisiología 1959 “Mecanismos de la síntesis del DNA” Descubrio DNA polimerasa I (primera de uso in vitro) Tuvo tres hijos: Roger, Nobel 2006 Thomas, Descubridor de DNA polimerasa II Kenneth, Arquitecto especializado en el diseño de laboratorios.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosomas Estructura propuesta por Roger Kornberg (1974). Premio Nobel Quimica 2006 “base molecular de la transcripción de DNA hacia RNA” Cromatosoma = Nucleosoma + proteina espaciadora. Nucleosoma posee coro de histonas (octámero) y ca 146 bp DNA. Compactación: 7x

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosomas Histonas poseen carga positiva y hacen función de poliaminas bacterianas. Coro formado por ocho histonas formando disco de 11 nm de diámetro. 146 bp de DNA se enrollan alrededor de coro. Particulas de coro separadas entre ellas por 54 bp (varía desde 8 hasta 114 bp) de DNA espaciador envuelto alrededor de proteina espaciadora (H1). Cantidad total en particula cromatosomal ca 200 bp de DNA. Las histonas interfieren con la unión de otras proteinas al DNA. El enrollamiento del DNA alrededor de las histonas es un proceso dinámico y regulado. 1.8 vueltas de DNA por nucleosoma.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosoma Coro nucleosomal compuesto por octamero de histonas. 2 x H2A 2 x H2B 2 x H3 2 x H4 6 x 11 nm dimensiones. Péptidos entre 10 y 25 kDa Cargados positivamente para interactuar con DNA negativo. Peptidos ricos en Arg y Lys. 6 nm 11 nm

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosoma Coro nucleosomal compuesto por octamero de histonas. 2 x H2A 2 x H2B 2 x H3 2 x H4 6 x 11 nm dimensiones. Péptidos entre 10 y 25 kDa Cargados positivamente para interactuar con DNA negativo. Peptidos ricos en Arg y Lys. 6 nm 11 nm

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosoma Coro nucleosomal compuesto por octamero de histonas. 2 x H2A Azules 2 x H2B Amarillos 2 x H3 Rojos 2 x H4 Verdes 6 x 11 nm dimensiones. Péptidos entre 10 y 25 kDa Cargados positivamente para interactuar con DNA negativo. Peptidos ricos en Arg y Lys. 6 nm 11 nm

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosoma Coro nucleosomal compuesto por octamero de histonas. 2 x H2A Azules 2 x H2B Amarillos 2 x H3 Rojos 2 x H4 Verdes 6 x 11 nm dimensiones. Péptidos entre 10 y 25 kDa Cargados positivamente para interactuar con DNA negativo. Peptidos ricos en Arg y Lys. 6 nm 11 nm

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosoma Coro nucleosomal compuesto por octamero de histonas. 2 x H2A Azules 2 x H2B Amarillos 2 x H3 Rojos 2 x H4 Verdes 6 x 11 nm dimensiones. Péptidos entre 10 y 25 kDa Cargados positivamente para interactuar con DNA negativo. Peptidos ricos en Arg y Lys. 6 nm 11 nm

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Nucleosoma Coro nucleosomal compuesto por octamero de histonas. 2 x H2A Azules 2 x H2B Amarillos 2 x H3 Rojos 2 x H4 Verdes 6 x 11 nm dimensiones. Péptidos entre 10 y 25 kDa Cargados positivamente para interactuar con DNA negativo. Peptidos ricos en Arg y Lys. 6 nm 11 nm

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Compactación y jerarquias organizacionales Formación del nucleosoma aporta al super-embobinamiento negativo (DNA in vivo)...por lo que no necesitamos una enzima para lograrlo (topo II no puede). Modelo de collar de cuentas en ME: Cuentas = nucleosomas Hilo = DNA espaciador H1 se une al DNA espaciador Pérdida de H1 no disrumpe nucleosoma Observable bajo microscopía electrónica.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Compactación y jerarquias organizacionales 1.5 % Agarose gel running at 150 VDC for 50 minutes. Viral & Human Genomics Lab

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Solenoide - Fibras de 30 nm

6 nucleosomas forman un arreglo helicoidal. Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Solenoide - Fibras de 30 nm 6 nucleosomas forman un arreglo helicoidal. El arreglo helicoidal resultado del super-embobinamiento solenoidal del “collar de cuentas” forma una fibra de 30 nm. El “collar de cuentas” se fija al andamiaje nuclear. Fibra cromatínica observada en ME. En general solo regiones inactivas (sin expresión genética). Corresponde a la mayor parte de la heterocromatina. Compactación: 100x 1 2 3 4 5 6

(c) Looped domains (300-nm fiber) Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Asas de 300 nm Fibras de 30 nm forman asas largas (300 nm de largo) ancladas al andamiaje nuclear. Cada asa posee aprox 75,000 bp Asas de 300 nm = Dominios estructurales (no confundir con dominios funcionales...otro cuento). Andamiaje nuclear 300 nm (c) Looped domains (300-nm fiber) Asas Andamio

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Rosetas En los cromosomas condensados (de metafase) las asas (entre 6 y 9) de 300 nm forman estructura helicoidal llamada kernel o roseta. Andamiaje nuclear = cromosómico

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Bobinas Las rosetas (ca 30) se apiñan una sobre otra de manera helicoidal formando las bobinas de las cromátides. Bobina cromatínica (solenoide cromatínico) = como el cordón teléfono. Asa Roseta Bobina

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Cromátides Bobinas cromatínicas empalmadas forman cromátides.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Cromosomas Cromosoma de metafase forma más compacta. Compactación: 15,000 x En los procariotas el cromosoma consiste en una sola molécula circular de DNA de doble cadena desnuda (con excepción de las poliaminas). Los eucariotas poseen un conjunto diploide de cromosomas lineares. DNA depletado de histonas Andamiaje cromosómico

Compactación y jerarquias organizacionales

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Cromosomas Especie Num. Cromosomas (diploide) D. melanogaster 8 Cobayo 16 Pichón 16 Caracol de tierra 24 Lombriz de tierra 36 Zorro 36 Gato 38 Cerdo 38 Ratón 40 Rata 42 Conejo 44 Hamster 44 Liebre 46 Humano 46 Gorillas, chimpances 48 Oveja 54 Elefante 56 Vaca 60 Burro 62 Caballo 64 Perro 78 Pollo 78 Carpa dorada 104

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Cromosomas Ophioglossum “Adder’s-tongue Fern” Tropical/Subtropical 1400 Cromosomas

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Centrómeros y Telómeros Centrómero formado por heterocromatina empleada en la fijación a huso mitótico/meiótico (microtúbulos). Telómero formado por heterocromatina repetitiva destinada a proteger extremos cromosómicos. Centrómeros y telómeros contienen cantidades abundantes de DNA de secuencia simple repetitiva (SSR). SSR: Multiples copias en tandem de secuencias cortas). SSR desempeñan funciones estructurales en telómeros y centrómeros. ¡Los centrómeros humanos poseen una secuencia de 170 bp repetida entre 500 y 3,000 veces! ¡Misma secuencia telomérica para todos los vertebrados! TTAGGG

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Telómeros Existen telómeros en los extremos de todos los cromosomas eucariotas lineares. Son una solución al “problema de la replicación de lo extremos cromosómicos”. Cada vez que la célula se divide se pierde algo del extremo terminal (telómero) de los cromosomas.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Telómeros y telomerasa La telomerasa extiende los extremos 3´ descubiertos que quedan después de retirar el primer de RNA al final de la replicación. Telomerasa es una transcriptasa inversa, sintetiza DNA a partir de RNA. El RNA de referencia forma parte de la misma Telomerasa. La Telomerasa agrega multiples copias de la secuencia de referencia al extremo 3'. La DNA polimerasa convencional entonces se encarga de extender los extremos 5'.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Panorama global