Lic. Carolina Chiconofri Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular. Lic. Luciana Garcia Lic. Carolina Chiconofri

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular OBJETIVOS Utilizar como herramienta los marcadores moleculares (microsatélites) de la vid para desarrollar un banco de datos a partir de plantas de origen indudable que puedan ser utilizados para la identificación de variedades de alta calidad enológica y de gran importancia en la vitivinicultura argentina. Ello permitirá a viveros y productores locales asegurar la identidad genética de sus materiales.   Siendo esta técnica complementaria a las determinaciones ya efectuadas por el Instituto Nacional de Vitivinicultura para la identificación de cultivares en vid por ampelografía.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular OBJETIVOS Ser laboratorio oficial que trabaje en conjunto con INASE (Instituto Nacional de la semilla), para introducir nuevo material vegetal y controlar el material ya existente dentro del sistema de fiscalización. Res. SAGPYA Nº 742/2001 (en proceso de modificación).

¿Qué es la Biología Molecular? Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular ¿Qué es la Biología Molecular? Estudia las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, incluyendo las relaciones entre el Ácido desoxirribonucleico (ADN), el Ácido ribonucleico (ARN), la síntesis de proteínas y el metabolismo; y cómo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un correcto funcionamiento de la célula.

El dogma central de la biología Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular El dogma central de la biología molecular describe el proceso en dos pasos (transcripción y traducción) por el cual la información genética lleva a la producción de proteínas: DNA → RNA → proteína.

Ácido desoxirribonucleico (ADN) Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Ácido desoxirribonucleico (ADN) El ADN tiene como papel principal el almacenamiento de la información genética de cada ser vivo. Desde el punto de vista químico, el ADN está formado por nucleótidos, y cada nucleótido, a su vez, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato que actúa como puente de cada nucleótido.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Replicación del ADN Es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (sintetizar una copia idéntica). De esta manera, de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas del ADN original.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Gracias a la complementación entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una célula madre a las células hijas y es la base de la herencia del material genético.

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Propiedades y función de las ADN polimerasas Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Propiedades y función de las ADN polimerasas Son enzimas que intervienen en el proceso de replicación del ADN. Llevan a cabo la síntesis de la nueva cadena de ADN emparejando los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) con los desoxirribonucleótidos complementarios correspondientes del ADN molde. El crecimiento de la cadena se produce en dirección 5' → 3‘. Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación. Además de participar en la elongación, desempeñan una función correctora y reparadora. Es importante que existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a mutaciones.

DIFERENCIACIÓN VARIETAL EN VID Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular DIFERENCIACIÓN VARIETAL EN VID Existen diversos métodos para diferenciar variedades de vid. El primero en utilizarse, para la identificación de cultivares de vid fue la ampelografía, basada en la descripción de elementos morfológicos de la planta, tales como brote, baya, racimo, y fundamentalmente, hoja. La ventaja que tiene esta técnica es su rapidez, siendo su limitante la influencia que pueden ejercer factores externos (eventos climáticos, plagas, enfermedades) sobre estos marcadores alterando su morfología normal, y su falta de precisión en casos de individuos genéticamente similares.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Otro método es el basado en el uso de marcadores bioquímicos (proteínas por ej.), pero presentan el inconveniente de ser afectados también por el ambiente y disponer de escasa cantidad de sistemas isoenzimáticos capaces de diferenciar la gran cantidad de variedades de vid que existen.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Las técnicas de Biología Molecular utilizan marcadores moleculares, los cuales detectan polimorfismo a nivel del ADN, permitiendo la identificación varietal en forma precisa. Tienen además la ventaja de no ser afectados por el ambiente, siendo entonces la mejor alternativa para diferenciar variedades genéticamente similares. Los microsatélites (SSR) son los marcadores moleculares más comunes en plantas y por lo tanto los más utilizados para identificar variedades de vid.

Características de los microsatélites Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Características de los microsatélites Los microsatélites son secuencias de ADN en las que un fragmento (cuyo tamaño va desde dos hasta seis pares de bases) se repite de manera consecutiva. Partiendo de esta hipótesis se diseñan primers o iniciadores (fragmentos de ADN que tienen la misma secuencia que los extremos de los microsatélites) para producir un alto número de copias de un microsatélite a través de una PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).

ENFERMEDADES VIRALES DE LA VID Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular ENFERMEDADES VIRALES DE LA VID La vid (Vitis vinifera L.) es una de las especies más cultivada en el mundo y al mismo tiempo hospedante de numerosos patógenos, entre los que destacan los virus, cuya peligrosidad es acentuada por la existencia de eficientes métodos de transmisión, principalmente vectores tales como nemátodos e insectos. Sin embargo, la principal causa de la diseminación a grandes distancias de los virus se debe a la propagación y comercialización de variedades y portainjertos infectados.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Actualmente ha sido posible identificar a más de 60 virus que infectan a la vid, aunque solo algunas especies son importantes por el daño económico que generan, tanto por su intrínseca agresividad como por su amplia diseminación en los viñedos. Se han diseñado primers específicos que reconocen alguna secuencia en particular del genoma de los virus mas importantes que infectan vid para poder ser analizados con RT-PCR tradicional y RT-PCR en tiempo real.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Los virus que se encuentran con mayor frecuencia en los viñedos del mundo son GLRaV-1, GLRaV-2 y GLRaV-3 (leafroll). Los síntomas en las hojas consisten en un enrrollamiento de la hoja, con leve amarillez de la lámina foliar en variedades de uva blanca y enrojecimiento en la de uva tinta, en la cual normalmente la modificación del color no incluye a las nervaduras. Este síntoma comienza a aparecer al final del verano y tiende a acentuarse en otoño. También hay corrimiento de racimos, sobre todo en los más pequeños, con bajo contenido en azúcares y mayor acidez. En variedades tintas es muy frecuente la decoloración parcial o total de las bayas al acercarse el periodo de cosecha. leafroll

Test serológicos (ELISA). Test moleculares. Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Los métodos que se utilizan para la detección de los virus de vid pueden ser: Test biológicos (basado en la propiedad de que esta enfermedad es trasmisible mediante injertos). Test serológicos (ELISA). Test moleculares.

Identificación varietal en vid por técnicas de Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Identificación varietal en vid por técnicas de Biología Molecular 1. Extracción del ADN

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Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular 2. PCR La propiedad de las enzimas ADN polimerasas para replicar hebras de ADN se utiliza para la reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR, para obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, amplificándolo para propósitos de investigación.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular En los procesos de PCR se requiere la utilización de enzimas polimerasas termoestables, como la polimerasa Taq, debido a que es necesario aplicar altas temperaturas para desnaturalizar la molécula de ADN.

3. Análisis de las amplificaciones Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular 3. Análisis de las amplificaciones Separación de fragmentos de ADN por electroforesis La molécula de ADN tiene carga eléctrica, los fosfatos proveen una carga neta negativa al ADN y esta carga es homogénea a lo largo de toda la molécula. En un campo eléctrico, el ADN migra hacia el polo positivo. Si la migración se realiza en un medio semi-sólido (por ejemplo agar, una especie de gel) ésta se dificulta, dado que el ADN debe pasar a través de poros en el gel.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Como consecuencia de la necesidad de atravesar estos poros, las moléculas de ADN más grandes verán retrasada su movilidad, mientras que las más pequeñas migrarán una mayor distancia en el mismo tiempo. En un mismo “gel” es posible evaluar distintas mezclas de fragmentos (muestras). El ADN no es visible a simple vista, por lo que utilizando colorantes como el bromuro de etidio (se intercala entre las bases del ADN), es posible lograr que el ADN emita fluorescencia cuando es iluminado con luz ultravioleta.

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Sistema de electroforesis con microchip y capilar Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Sistema de electroforesis con microchip y capilar

Poner a punto las distintas técnicas. Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular PROYECTO DE TRABAJO Poner a punto las distintas técnicas. Realizar un banco de datos a partir de distintas variedades de plantas de vitis vinífera de origen indudable. Analizar a lo largo de un año las distintas partes de la planta, para determinar cuales son las más adecuadas para realizar la extracción del ADN.

Identificación varietal y Detección de enfermedades en vid por técnicas de Biología Molecular Complementar a las técnicas ya realizadas por el INV (Identificación varietal en vid por ampelografía y caracterización varietal). Desarrollar los métodos para determinar las enfermedades más comunes en vid por técnicas de biología molecular.

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