Desarrollo de nuevas metodologías para determinación de capacidad antioxidante de polifenoles Ph.D. Elias Atala Riffo

MUERTES POR ENFERMEDAD CVD MUERTES POR TODAS LAS CAUSAS LOW INTAKE OF FRUITS, BERRIES AND VEGETABLES IS ASSOCIATED WITH EXCESS MORTALITY IN MEN: THE KUOPIO ISCHAEMIC HEART DISEASE RISK FACTOR (KIHD) STUDY1. Rissanen et al. J. Nutr. 133: 199–204 (2003). MUERTES POR ENFERMEDAD CVD MUERTES POR TODAS LAS CAUSAS EN UNA POBLACIÓN DE FINLANDESES DE MEDIANA EDAD, LOS QUINTILES QUE TUVIERON UNA MAYOR INGESTA DE FRUTAS-BERRIES -VERDURAS MOSTRARON MENORES TASAS DE MUERTE ACUMULATIVAS, POR CAUSAS CV O MULTIPLES. Paredes-Lòpez et al. Berries: Improving Human Health and Healthy Aging, and Promoting Quality Life—A Review. Plant Foods Hum Nutr (2010) Basu et al. Berries: Emerging impact on cardiovascular health. Nutr. Rev. (2010)

Resumen de la evidencia científica de la relación entre consumo de frutas y verduras y disminución del riesgo de padecer enfermedades crónicas. Boeing et al. Critical review: vegetables and fruit in the prevention of chronic diseases. Eur J Nutr. (2012) 51(6):637-63

Se han descrito más de 3000 polifenoles diferentes. (PFT) FRUTAS & HORTALIZAS Se han descrito más de 3000 polifenoles diferentes.

Grupos y subgrupos de polifenoles presentes en frutas y verduras Se han descrito más de 4000 polifenoles diferentes

Ácidos fenólicos Flavonoides OH OH OH OH OH OH O OH Derivados de Ácidos benzoicos Derivados de Ácidos Cinámico OH O OH OH OH Ácido gálico… Quercetina, galangina, rutina… Ácido ferúlico, caféico…

Acción antioxidante directa Transferencia de Hidrogeno (HAT) / Transferencia de Electrones (SET) (n)ROO• + PhOH → (n)ROOH + PhO• / (n)ROO• + PhOH → (n)ROO− + [PhOH]•+ ROO• ROOH PhOH Acción antioxidante directa

ROO. Método ORAC Método ORAC: (1) (2) (3) (4) BLANCO ANTIOXIDANTE RADICAL LIBRE Ensayos competitivos de un antioxidante (PhOH) y una molécula blanco (MB) Ensayo ORAC ROO. C. López-Alarcón, E. Lissi, Free Radical Research, 39;7 (2005) 729–736. D. Di Majo et al. Journal of Food Composition and Analysis, 24 (2011) 265-269.

Estiman capacidad AOX a pH neutro Metodologías tipo ORAC Estiman capacidad AOX a pH neutro Diferentes moléculas blanco: Diferente información antioxidante Generación de tiempos de inducción por XH Ampliamente utilizada. Creación de bases de datos para una amplia variedad de frutas y verduras. www.PortalAntioxidantes.com ORAC-Fl Relacionados con la estequiometria de XH frente a ROO● Cambios en la vi de consumo de PGR ORAC-PGR Relacionado con la reactividad de XH frente a ROO● H. Speisky et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 12;60 (2012) 8851-8859. E. Pino, A. M. Campos, E. Lissi, International Journal of Chemical Kinetics, 35;10 (2003) 525–531.

ER + Producto de oxidación de PGR

Determinación de fenoles totales simples, económico, no requiere equipos especializados habilidad de reducir el reactivo de Folin (mixtura de fosfotúngstico/fosfomolíbdico) MÉTODO DE FOLIN-CIOCALTEU (FC) [Singleton VL, Rossi JA (1965) Am J Enol Vitic 16:144–158]. Mo6+ (amarillo) + ArOH → Mo5+ (azul a 750 nm) + [ArOH]•+

¿o metabolitos oxidados? Mecanismo de acción antioxidante indirecto de polifenoles ¿o metabolitos oxidados? POLIFENOLES Aumento en la producción celular de enzimas antioxidantes

Agradecimientos: Universidad de Talca Comité organizador PIEI-ES Lab Agradecimientos: Universidad de Talca Comité organizador PIEI-ES Lab. AOX INTA-UCH Lab. Radicales Libres PUC Muchas gracias

Fuente: http://www.portalantioxidantes.com (INTA)

En condiciones normales la velocidad de generación de ER es similar a la capacidad del organismo para neutralizarlas. ER

Estado de Estrés Oxidativo Introducción Macromoléculas ERN ERO El daño a macromoléculas se asocia a la patogenia de diversas enfermedades.* Proteínas ER Defensas antioxidantes Lípidos ER Estado de Estrés Oxidativo ADN ER *B.Halliwell, J. M. C. Gutteridge. Thirdedition 1999, Oxoford Science Publications. Z. Ďuračková. Physiol. res. 59: 459-469; 2010.

¿ Por qué estudiar el estrés oxidativo? Introducción ¿ Por qué estudiar el estrés oxidativo? Concepto: daño producido por la superproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) de manera que se produce un desequilibrio entre éstas y los mecanismos de defensa antioxidante . patogénesis de enfermedades

patogénesis de enfermedades Diabetes Mellitus Enfermedades cardiovasculares neurodegenerativas Alzheimer Parkinson Inmunoinflamatorias Ciertos tipos de cáncer

Metodología ORAC Introducción Curso temporal de la reacción entre fluoresceína (70 nM) y radicales peroxilo. (λex= 493 nm, λem= 515 nm). () Control; () quercetina 1 µM. [ABAP] = 10 mM. t = 37ºC. Ou B, Hampsch-Woodill M, Prior R. J. Agric. Food Chem. 2001;49:4619-4626

Metodología ORAC Introducción  2HCl ABAP

Metodología ORAC Introducción Método ORAC-pirogalol rojo (ORAC-PGR): A B Protección de Fluoresceína (A) o pirogalol rojo (B) por Trolox. () Control. López-Alarcón C, Lissi E. Free Radic. Res., 2005;39:729-736 López-Alarcón C, Lissi E. Free Radic. Res., 2006;40:979-985

Estado de Estrés Oxidativo Introducción ERN ERO El daño a macromoléculas se asocia a la patogenia de diversas enfermedades. ER Sistemas antioxidantes ER ER ER Estado de Estrés Oxidativo

En condiciones normales todos los organismos aerobios generan especies reactivas (ER)

Fuentes biológicas de las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) Introducción Fuentes biológicas de las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) In vivo, las ROS se forman por tres mecanismos: • Reacción secundaria del transporte electrónico mitocondrial. • Reacción del O2●- con iones metálicos. • Reacciones enzimáticas normales (oxidasas). 2O2●- + 2H+ O2 + H2O2 Fe3+ + O2●- Fe2+ + O2 Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO● + OH- SOD Reacción de Fenton Generación O2●- mitocondrial

Introducción Anión superóxido (O2●- ) como especie clave O2●- NO● HO● +NO2● ONOO- H2O2 Fe2+ Fe3+ TOXICIDAD CELULAR HO●

¿ Qué tipos de defensas existen frente al estrés oxidativo ? Introducción ¿ Qué tipos de defensas existen frente al estrés oxidativo ? Defensa antioxidante No enzimáticas endógenas exógenas enzimáticas

Defensas antioxidantes enzimáticas Introducción Defensas antioxidantes enzimáticas ENDÓGENOS Tioredoxinas SOD CAT GSH-peroxidasa GSH-transferasa

Mecanismos de defensa antioxidante enzimático Introducción Mecanismos de defensa antioxidante enzimático Radicales libres GSH peroxidasa GSH reductasa

Defensas antioxidantes no enzimáticos Introducción Defensas antioxidantes no enzimáticos ENDÓGENOS glutatión bilirrubina albúmina ácido úrico EXÓGENOS Tocoferol (vitamina E) B-caroteno (vitamina A) ácido ascórbico (vitamina c) POLIFENOLES

(PFT) FRUTAS & HORTALIZAS

METODOLOGÍAS DETERMINACIÓN ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ENSAYO ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) ROO· + FL + AOX ROOH + FL (ABC FL.) ROO·