XVI Congreso Internacional y XLI Congreso Nacional de Fitopatología Herramientas bioquímicas para la taxonomía integrativa de Meloidogyne spp. María Gabriela Medina Canales México, D.F, a 20 de julio de 2014

Identificación Caracterización enzimática Morfológico y morfométrico M Patrones perineales Estiletes de machos , hembras y J2 Cabeza de los machos y J2 Morfológico y morfométrico M É T O D S Algodón “Deltapine 61” Tabaco ”NC 95” Pimienta “California Wonder” Sandía “Charleston Gray” Cacahuate “Florunner” Tomate “Rutgers” Hospedantes diferenciales Caracterización molecular Amplificación por PCR y RFLP de los ITS Amplificación de los IGS de DNAr Caracterización enzimática Eisenback, 1991; Karssen y Moens,2006

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Identificación Caracterización enzimática Morfológico y morfométrico M Patrones perineales Estiletes de machos , hembras y J2 Cabeza de los machos y J2 Morfológico y morfométrico M É T O D S Algodón “Deltapine 61” Tabaco ”NC 95” Pimienta “California Wonder” Sandía “Charleston Gray” Cacahuate “Florunner” Tomate “Rutgers” Hospedantes diferenciales Caracterización molecular Amplificación por PCR y RFLP de los ITS Amplificación de los IGS de DNAr Caracterización enzimática Eisenback, 1991; Karssen y Moens,2006

Caracterización enzimática Sensible Estabilidad Esterasa mayor valor diagnóstico Fenotipos isoenzimáticos, de malato deshidrogenasa y esterasa, de diferentes especies de Meloidogyne. Karssen y Moens,2006; Brito et al., 2010

Antecedentes Uso de fenotipos enzimáticos para la identificación de especies de Meloidogyne. Esbenshade y Triantaphyllou. Polimorfismo de isoenzimas de esterasa en zimogramas de poblaciones de Meloidogyne detectadas por el Phastsystem. Molinari Variabilidad isoenzimática de poblaciones de Meloidogyne spp. provenientes de regiones brasileñas productoras de soya. Da Cunha Meloidogyne javanica parasito de cacahuate. Tomaszewski et al. 1985 1994 2001 2003

Antecedentes Caracterización de especies de Meloidogyne de China usando fenotipos isoenzimáticos y RFLP de DNA mitocondrial amplificado. Jianhua et al. Patrones isoenzimáticos de poblaciones venezolanas de Meloidogyne spp. Crozzoli et al. Plantas ornamentales infectadas con Meloidogyne spp. en Florida. Brito et al. Diversidad de Meloidogyne spp. parasitando en plantas de la Isla de Martinica. Quénéhervé et al. Caracterización morfológica, enzimática y molecular de M. arenaria de Anubias barteri var. caladiitolia en China. Huang et al. 2004 2005 2010 2011 2013

Metodología Muestreo Extracción Tinción Electroforesis A B C Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Extracción de proteínas 1 Hembra + 10mL de regulador de extracción Esterasa. 20 g de sacarosa o glicerol + 2 mL de tritón X-100. Mdh y Sod. 20 g de sacarosa o glicerol + 0.1 g de TRIS + 0.1 g de ascorbato + 0.1 g cisteína. Ajustar pH a 8.0 con HCl Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Electroforesis Corrimiento 30 min 80 volts + 70 min 250 volts Gel concentrador 0.5 mL de sol. B 1 mL sol. D 0.5 mL sol. E 2 mL sol. F Gel separador 4 mL de sol. G 1 mL agua 2 mL sol. C 1 mL sol. A o A2 Buffer TRIS 6 g Glicina 28 g Agua 1 L pH=8.3 Diluir 1:9 Corrimiento 30 min 80 volts + 70 min 250 volts Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Revelado Incubar 1 hora a 37ºC Solución para teñir Mdh / Sod 10 mL sol. A 15 mL sol B 50 mg NAD 30 mg NBT 50 mL agua 2 mg PMS en 26 mL agua Solución para teñir Esterasa 100 mL regulador fosfatos 30 mg EDTA 60 mg fast blue RR 40 mg a-naftilacetato/2 mL acetona -Sol. A 10.6 g Na2CO3 + 13.4 g malato -Sol. B 6.06 g TRIS pH = 7.1 Incubar 1 hora a 37ºC Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Interpretación de resultados Banda 1 Banda 2 Rm = Migración de la banda proteica (a) longitud total recorrida del gel (b) x 100 a a b Rm banda 1= 3.8 x 100 = 46.3 8.2 Fenotipo de esterasa H1 correspondiente a M. hapla. Rm banda 2= 3.2 x 100 = 39 8.2 Fenotipo de esterasa S1 correspondiente a M.chitwodii. Esbenshade y Triantaphyllou, 1985; Alquicira-Jímenez, 2014

Ejemplos de fenotipos de EST Fenotipo de esterasa y patron perineal de Meloidogyne incognita. Se observa el fenotipo I1 que presenta un Rm = 43,0 Fenotipo de esterasa para Meloidogyne sp. Se observa el fenotipo que presenta un Rm = 10,1 y 52. 9 Alquicira-Jímenez, 2014

Ejemplos de fenotipos MDH a b Fenotipo de malato deshidrogenasa para Meloidogyne arenaria. Se observa el fenotipo N1, con un Rm = 20 designado así por no ser específico para esta especie. Alquicira-Jímenez, 2014

Resultados Representación esquemática de los fenotipos isoenzimáticos de esterasa observados en Meloidogyne spp. J2a = M. javanica, S1 = M. chitwoodi, H1 = M. hapla, Sp 1 = Especie no identificada, G1 = M. graminis, M2 = M. enterolobii, I1 = M. incognita, A1 , A2a, A3= M. arenaria. ; Alquicira-Jímenez, 2014

Fenotipos de esterasa observado en 291 poblaciones en estudio de 16 especies de Meloidogyne. Cada fenotipo es designado por letras que sugieren la especie a la que pertenece (A = arenaria, H = hapla, I = incognita, J =javanica) o por la velocidad de migración (VS = muy lento, S = lento, M = medio, F = rápido, VF = muy rápido) y el número indica el número de bandas presentes (Esbenshade y Triantaphyllou, 1985). VS1 = M. graminicola, VS1-S1a = M. carolinensis, VS1-M2 = Meloidogyne sp. S1= M. chitwoodi, S1-M1 = M. arenaria, S2-M1 = M. hispanica, M1 = M. microtyla, M3 = Meloidogyne sp. M3a = M. cruciana, M3F1= M. arenaria, F1 = M. querciana, VF1 = M. naasi (Esbenshade y Triantaphyllou, 1985)

Fenotipo de esterasa identificado de hembras observadas en geles de poliacrilamida. Se muestras tres bandas de actividad enzimática características de M. javanica y dos bandas de actividad enzimática características de M. arenaria (flecha) (Tomaszewsk et al., 1994).

Fenotipos de esterasa (EST) y malato deshidrogenasa (MDH) observados en 96 poblaciones de Meloidogyne spp. de platano (Musa sp.) (Cofcewicz et al., 2005).

Representación esquemática de los fenotipos de esterase de Meloidogyne spp. que infectan a ornamentales en Florida. A2 = M. arenaria, Mf3 = M. floridensis, Mg1 = M. graminis, I1 and I2 = M. incognita, J3 and J2 = M. javanica, VS1-S1 = M. mayaguensis, Ep2 = M. sp.1, Mc1 = M. sp.2, Vo1 = M. sp.3, Vo2 = M. sp.4, Gj2 = M. sp.5 y Cv2 = M. sp. 6. Rm = Movilidad relativa (Brito et al., 2010).

Fenotipos de esterasa (EST) y malato deshidrogenasa (MDH) obtenidos por electroforesis de 96 raíces y suelo de varias plantas en Martinica (Quénéhervé et al., 2011).

Fenotipos isoenzimáticos de esterasa y malato deshidrogenasa de M Fenotipos isoenzimáticos de esterasa y malato deshidrogenasa de M. arenaria proveniente de Anubias barteri var. caladiitolia. Líneas 1 y 3: M. javanica; Línea 2: M. arenaria de Anubias barteri var. caladiitolia (Huang et al., 2013).

M. enterolobii M. mayaguensis Caso de estudio M. enterolobii M. mayaguensis Yang y Eisenback, 1983 Rammah y Hirschmann, 1988 Xu et al., 2004 se dan cuenta de que son los mismos ya que tienen el mismo fenotipo de EST (VS1-S1) y lo corroboraron con métodos moleculares. Fenotipo EST = VS1-S1 Fenotipo EST = VS1-S1

GRACIAS