PCR (Polymerase Chain Reaction)

“A partir de una copia de DNA única, el PCR permite obtener 100 mil millones de copias idénticas en una tarde. La técnica es sencilla. Sólo requiere un tubo, unos cuantos reactivos y una fuente de calor”. Kary B. Mullis (Scientific American, 1993)

Kary B. Mullis Premio Nobel de Química (1993)

Los años previos… 1973 PhD UC Berkeley Doctorado en Bioquímica 1979 Cetus Corporation Síntesis de oligonucleótidos 1983 Responsable laboratorio síntesis DNA (Cetus) Invención del PCR

San Francisco - Mendocino (California, Abril 1983)

“No funcionará. Además, es tan simple,. que seguro que “No funcionará. Además, es tan simple, que seguro que alguien, en algún sitio, ya lo ha intentado.”

aparentemente positivo. 8 Septiembre 1983 La primera reacción de PCR. PCR01 16 Diciembre 1983 El primer resultado aparentemente positivo.

Junio 1984: Cetus crea el “grupo de PCR”. Marzo 1985: primera patente. Mayo 1987: primer artículo describiendo el método.

PCR en $$$ 1985 Kary Mullis recibe de Cetus una bonificación de: $10.000 (un 1 seguido de 4 ceros) 1991 Hoffmann-La Roche paga por la patente: $300 millones (un 3 seguido de 8 ceros) 2005 Total de royalties generados al cabo de 20 años: $2.000 millones (un 2 seguido de 9 ceros)

¿En qué consiste la técnica de PCR?

El PCR es una técnica para copiar DNA.

A diferencia del proceso de replicación, el PCR copia fragmentos específicos de DNA.

El PCR permite obtener millones de copias a partir de un fragmento de DNA.

¿Cuáles son las aplicaciones del PCR?

Uno de los campos de aplicación habituales del PCR es la ciencia forense.

Mediante el PCR, una pequeña cantidad de DNA procedente de unas pocas células es suficiente para identificar a una persona.

Antes de la invención del PCR era muy difícil obtener suficiente DNA en la escena del crimen para una identificación positiva.

Otros campo de aplicación del PCR son el diagnóstico de enfermedades hereditarias, Progeria o envejecimiento prematuro.

el establecimiento de relaciones genéticas entre individuos…

…y la investigación de restos paleontológicos.

¿Cómo puede obtener el PCR millones de copias de un fragmento específico de DNA en unas pocas horas?

La duplicación del DNA durante la mitosis requiere la intervención de una compleja maquinaria molecular.

Afortunadamente el PCR se sirve de un único enzima (DNA polimerasa) y de una fuente de energía (temperatura).

La reacción de PCR consta de 3 etapas. Cada etapa requiere una temperatura particular a fin de que se lleve a cabo una reacción específica.

Desnaturalización (separación de las hebras del DNA)

“Annealing” (unión de los “primers” por complementariedad)

Los “primers” son fragmentos de DNA sintético de corta longitud (~ 20 nucleótidos). Se diseñan de manera que sean complementarios a una secuencia conocida del fragmento a amplificar.

En una reacción de PCR se utilizan dos “primers” (uno en cada extremo del fragmento a amplificar). ↓ 3’ → 5’ →

Extensión (a cargo de la polimerasa)

Elevamos la temperatura a 72 °C para que la polimerasa pueda extender las cadenas de DNA. ↓

La polimerasa extiende las cadenas hasta que se alcanza el extremo del DNA o las condiciones de temperatura cambian. En el segundo ciclo la polimerasa extiende las cadenas hasta el extremo en que se encuentra el segundo “primer”.

El ciclo se repite una y otra vez… En cada ciclo se dobla el número de fragmentos copiados.

“Ingredientes” de la reacción PCR: DNA a amplificar Primers dNTPs Solución salina con Mg2+ Polimerasa

Los “ingredientes” de la reacción deben ser capaces de soportar altas temperaturas. Taq polimerasa (Thermophilus aquaticus es una bacteria que vive en medios a 50-80°C)

Fuentes del parque de Yellowstone (EUA)

La reacción de PCR se lleva a cabo en un termociclador 1985 2000

¿Cómo puede identificarse un individuo a partir del análisis de una muestra biológica mediante la técnica de PCR?

Los fragmentos amplificados migran en función de su tamaño en un gel de electroforesis. Figure 8-47a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

En ocasiones los fragmentos entre los cuales se unen los “primers” varían de longitud entre individuos.

Estos fragmentos se denominan microsatélites Estos fragmentos se denominan microsatélites. Se trata de secuencias cortas y repetidas de nucleótidos. Para averiguar si una muestra pertenece a un individuo se amplifican fragmentos que contengan regiones de microsatélites.

Figure 8-47b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)