MUTACIONES

¿Cómo surgen las variantes genéticas en la naturaleza? Mutación: Proceso por el que un gen cambia de una forma alélica a otra. Mutación versus Reversión

Las mutaciones pueden afectar: Región promotora Región codificante Las mutaciones pueden generar: Pérdida de función Ganancia de función

En organismos diploides las mutaciones de pérdida de función generalmente son recesivas

Mutaciones en la región reguladora de un gen pueden provocar pérdida o ganancia de función

A nivel del ADN las mutaciones pueden ser originadas por: Sustituciones Transiciones : A  G (purinas) ; C  T (pirimidinas) Transversiones: purina  pirimidina Inserciones Deleciones Impedimento físico

A nivel de la proteína las mutaciones pueden ser: A) Mutación silenciosa (AGG -> CGG ambos determinan Arg) B) Mutación de cambio de sentido - Sinónima (AAA Lys -> AGA Arg ambos aa básicos) - No sinónima (UUU Phe hidrofobico -> UCU Ser polar) C) Mutación sin sentido (CAG Gln -> UAG Stop) D) Mutación de cambio del marco de lectura (o de cambio de fase) E) Reversiones - Exacta (AAA Lys -> GAA Glu -> AAA Lys) - Equivalente (UCC Ser -> UGC Cys -> AGC Ser) (CGG Arg -> CCC Pro -> CAC His)

Mutaciones de cambio en el marco de lectura GCU Ala Ala Ala Ala Ala Ala Silvestre GCU Ala Ala Ser Cys Cys Cys AGC UGC UGC UGC A Inserción GCU Ala Ala Ala Ala Leu Leu CUG CUG G Deleción

Las mutaciones se producen en forma: Espontánea: Causas: * Errores en la replicación (fidelidad ADN pol, tautomeri- zación de bases) * Lesiones espontáneas (Deaminación) Inducida: Agentes mutagénicos * Biológicos * Físicos * Químicos

Las mutaciones se producen en el ADN y se heredan a las células hijas durante la división celular

Mecanismos que aseguran la fidelidad de la ADN polimerasa

Tautomerización

Tautomerización de bases Emparejamiento normal entre las formas “ceto” (y “amino”) de las bases Emparejamientos erróneos causados por las formas tautoméricas raras de las bases

Ejemplo de transición provocada por la aparición de la forma enol de G durante la replicación

Deaminación Además: Deaminación de G -> xantina, bloquea la replicación (no mutagénica) Deaminación de A -> hipoxantina, empareja con C en lugar de T

Agente Efecto en células vivas Carcinogénico Causa cáncer (transformación neoplásica de células eucarióticas) Clastogénico Causa fragmentación de cromosomas Mutagénico Causa mutaciones (puede producir todos los otros efectos) Oncogénico Induce a la formación de tumores Teratogénico Produce anormalidades en el desarrollo

Mutágenos Biológicos Físicos Químicos Transposones, virus Radiación UV, Rayos X Químicos Análogos de bases (5-bromo uracilo, 2-aminopurina) Agentes intercalantes (naranja de acridina) Agentes alquilantes (etilmetanosulfonato, nitrosoguanidina)

Transposones Secuencia de inserción ADN receptor TC CTCTGCC AGGAGACGG Transposasa Repeticiones terminales invertidas Transposones

Mecanismos de acción generales de los mutágenos físicos y químicos: a) Sustitución de bases b) Modificación de bases c) Agentes intercalantes d) Impedimento físico

Mecanismo de sustitución de bases 5-Br-uracilo (enol) 2-aminopurina

Mecanismo de modificación de bases

Mutágenos del tipo agentes intercalantes

Impedimento físico: formación de aductos Fotoproductos generados por la luz UV

Mutación somática versus mutación germinal

Mecanismos de reparación

Reversión del daño * Fotorreparación * Ligamiento de rupturas simple hebra Remoción del daño * Reparación por escisión de bases * Reparación de “mismatch” Tolerancia al daño * Reparación por recombinación * Reparación mutagénica

Reparación de fotodímeros de pirimidina por fotoliasa y luz blanca

ADN ligasa sella los enlaces fosfodiester interrumpidos

La glicosilasa remueve la base dañada, el sitio AP es reconocido por una endonucleasa y, ayudada por una exonucleasa escinde un fragmento de ADN que es rellenado por ADNpol I y sellado por la ligasa

¿Cómo identifica la célula la hebra recién sintetizada para saber cuál es, probablemente, la base “mutante” en un mal apareamiento?

Escisión frente a un aducto

Reparación mutagénica

Fenotipos mutantes A) Mutaciones morfológicas B) Mutaciones letales C) Mutaciones bioquímicas D) Mutaciones condicionales

sus genes y la secuencia histórica de El fenotipo de un individuo es una consecuencia de la interacción entre sus genes y la secuencia histórica de las condiciones ambientales a las que ha estado expuesto. Mutaciones

Mutagénesis como herramienta de mejoramiento genético de microorganismos

Objetivo de la biotecnología de microorganismos Cepas altamente productoras: Mejoramiento genético Simple selección Manipulación genética Mutagénesis al azar y selección sitio dirigida Variabilidad intra-específica

EJEMPLO: Ruta de biosíntesis del -caroteno GGPP Fitoeno sintetasa Prefitoeno pirofosfato Fitoeno Fitoeno desaturasa Licopeno Licopeno ciclasa Genes!!!!! -caroteno

Mutación de una secuencia reguladora en cis Ejemplos de mutaciones que pueden inducir a la sobreproducción de un producto (deseable en biotecnología): Mutación de una secuencia reguladora en cis Mutación del gen que codifica para un elemento regulador en trans Elementos reguladores en trans o factores de transcripción específicos Represor Factores de transcripción generales

Estandarización de las condiciones de mutagénesis Cultivo en fase exponencial Fuente UV (254 nm) Oscuridad por 24 h Dilución seriada Plaqueo en medio sólido Conteo de colonias Determinación del tiempo de exposición que provoca 95 a 99% de mortalidad

Mutagénesis y selección Oscuridad por 24 h Dilución seriada Plaqueo en medio sólido Control Condición de selección Clones seleccionados Re-chequeo Determinar la fijación de la mutación Caracterización

Clones mutantes de Tetraselmis suecica sometidos a selección en presencia de Cerulenina, un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos Control Cerulenina 2 g/ml Mutantes potencialmente mejorados en su capacidad de acumular PUFAs