Cap 6 DNA: Replicación Reparación y Recombinación JA Cardé, PhD Universidad Adventista Alberts et al.

Genoma: todo el complemento cromosómico de un organismo Replicación fidedigna de esta información es crucial para mantener la vida Implica: Copiarlo Corregirlo Variarlo 06_01_Hereditary info.jpg 06_01_Hereditary info.jpg

06_02_DNA template.jpg Replicación DNA sirve de templado Complementaridad preferencial Polaridad 3’OH 06_02_DNA template.jpg 06_02_DNA template.jpg

06_03_own duplication.jpg Replicación Parental S Hija S’ Copia o replicado 8 horas-> 1000 libros ->2 errores Por quién? Maquinaria de replicación 06_03_own duplication.jpg 06_03_own duplication.jpg

06_04_replic.rounds.jpg Replicación Semiconservativa

06_05_replic.origin.jpg Replicación dos cadenas complementarias, enlaces de H = estables Se separa por temp cerca de 100, como lo hace a nuestra temp de 37C? Origen de replicación Proteínas iniciadoras Secuencias específicas A-T “stretches”(secciones) 1 ori vs varios 06_05_replic.origin.jpg 06_05_replic.origin.jpg

06_06_plasmid.jpg 06_06_plasmid.jpg How We Know

06_07_microarrays.jpg 06_07_microarrays.jpg

06_08_monitorprogress.jpg 06_08_monitorprogress.jpg

06_09_Replic.forks.jpg 06_09_Replic.forks.jpg Tenedor de replicacion – lugares donde ocurre la sintesis de DNA

area donde se separan las cadenas, Forma Y. Bidireccional Replication fork area donde se separan las cadenas, Forma Y. Bidireccional Rápido en bacterias, lento en eucariotas…. Por que ? (complejo DNA-prot) Que se necesita? Que hace falta para el proceso: DNA polimerasa – enzima que sintetiza DNA nuevo a partir de de hebra vieja Catal

06_10_5prime_3prime.jpg Templado Polaridad 5’-3’ Asimetría Discontínua Leading/lagging 06_10_5prime_3prime.jpg La DDDP – cataliza la adicion de nuevos nucleotidos al terminal 3’ de la cadena naciente * Enlace de alta energía

06_11_oppositepolarity.jpg Replication fork: asimétrico Antiparalelas: opuestas Cadenas siempre crecen 5‘3’ no en la misma dirección 06_11_oppositepolarity.jpg 06_11_oppositepolarity.jpg El tenedor de replicacion es asimetrico: la direccion 5 del proceso trae un problema al tenedor Enzima especial para cada cadena? Cadena leading - contínua Cadena lagging – discontínua

06_12_asymmetrical.jpg Leading/lagging Contínua y discontínua Okazaki Leading vs Lagging Contínua vs Discontínua

06_13_polymerase1.jpg DNA pol Autocorrección Añade nucleótidos 3’OH Revisa pareo Incorrecto? corta enlace fosfodiest libera ncltd y vuelve DNA Polimerasa 53 DNAExonucleasa 35 06_13_polymerase1.jpg 06_13_polymerase1.jpg Durante el proceso la DNA pol revisa su propio trabajo

06_14_polymerase2.jpg DNA Pol : Dominios Polimerización Edición Polimerizacion y edicion son procesos coordinados por dos secciones de la misma enzima Dominios – en la molecula Polimerización Edición

06_15_proofreading.jpg Porque sólo polimeriza 5-3? Este mecanismo de proofreading explica porq la pol SOLO puede anadir ncltds de 53 ASIGNADO!!!!!

06_16_lagging strand.jpg Replicación por Fragmentos Lagging Primers: fragmentos de RNA Primasas DNA pol RNAsa Ligasa DNA pol repara 06_16_lagging strand.jpg Que se necesita: templado, NTPs, enzima polimerasa de DNA (proofreading) Pero la enzima solo anade al terminal 3’OH preexistente! Y pareado a cadena..

06_17_group proteins.jpg Proteínas del Replication Fork La replicacion requiere la cooperacion de muchas proteinas, estas forman una Maquinaria de replicacion multienzimatica que lleva a cabo el proceso Proteínas del Replication Fork Nombre y función

DNA replication problem at chromosome ends El problema de la replicacion del terminal cromosomico: DNA pol no puede iniciar sintesis de novo, solo con terminal 3’OH ibre Fig. 12-11 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

Telómeros Replicación Telomerasa Alargar el terminal 3’ del cromosoma. Es una transcriptasa reversa. Contiene proteína y RNA. (AUCCCAAUC) Secuencia de RNA permite que forme complejo con la unidad repetitiva del telomero. Sintetiza DNA a partir de un molde de RNA. Toda replicacion procede de 35 en el templado y 53 en la cadena nueva

06_18_telomeres.jpg Replicación: Telómeros Telomerasa Telómeros Secuencias repetidas RT? 06_18_telomeres.jpg 06_18_telomeres.jpg El problema de los terminales 5’ NUEVOS para replicacion?

Telomerase replicates chromosome ends La enzima usa su propio RNA como templado para la sintesis de DNA el cual se une al extremo del cromosoma Fig. 12-12 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

Disruption of the protective complex at telomeres results in chromosome fusion Ademas de replicacion de terminales los telomeros funcionan com oproteccion contra la union de cromosomas Drosophila mutante en prot que protégé la estructura del telomero Fig. 12-14 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

DNA: Reparación -Cambios genéticos se acumulan (evolución) -Detrimentales individualmente hablando -Estabilidad genética garantiza supervivencia -Estabilidad se consigue: - Replicación - Reparación Aun cuando hoy pocos errores, hay una maquinaria para corregirlos y bajarlos a 1 en 10e9

06_19_sickle_cell.jpg DNA Reparación Mutaciones Cambio permanente De punto Sickel cell Hgb B-globina A x T E x V 06_19_sickle_cell.jpg 06_19_sickle_cell.jpg Mutaciones – cambios permanentes que ocurren por q la maquinaria de replicacion no corrige algun error

06_20_cancer_age.jpg Mutaciones somáticas vs germinales Acumulación de mutaciones Daño permanente=transformación Relación entre edad y aumento de mutaciones PLT: -la fidelidad con la que se replique y se mantenga estable el DNA es importante tanto para: -células germinales -células somáticas 06_20_cancer_age.jpg 06_20_cancer_age.jpg Si el cambio es en cel germinales se pasa de generacion en generacion

06_21_Errors corrected.jpg Errores: se corrigen 06_21_Errors corrected.jpg 06_21_Errors corrected.jpg Hay un sistema de reparacion de errores de pareo que se le escapan a la polimerasa - la corrección debe ser usando la cadena vieja como templado!!!

06_22_DNA mismatch.jpg Cómo se distingue entre la vieja y la nueva? Nicks Cuan importante es la reparación de los mismatch? Cáncer de colón Enzima de reparación mutante Heterocigotos=normal hasta que muta la 2da 06_22_DNA mismatch.jpg Mecanismo de reparacion asociado a cancer de colon La herencia de un gene del sistema de correccion mutado predispone a cancer

-Depurinación: A,G, no se rompen enlaces fosfodiestéricos, saca la base Deaminación: perdida de NH2 en C U :Espontáneas ambas 06_23_Depurination.jpg 06_23_Depurination.jpg – no afectan el esqueleto azucar fosfato Errores q se pueden encontrar: por el constante bombardeo y danos en la celula

06_24_radiation.jpg Dímeros de Timina: Radiación UV UV – dimeros de timina - piel

Deaminación: resulta en A por G Depurinación: deleción 06_25_mutations.jpg 06_25_mutations.jpg Si no se corrigen – terminamos en mutaciones Si no se corrrigen: producen mutaciones

Reparación: -Excisión: reconocer el DNA dañado y removerlos por nucleasas, se crea un ga p(hueco) -Resíntesis: DNA pol repara desde el 3’OH, rellena el hueco usando templado y complementaridad. (Otra DNA pol pero funciona igual) -Sellado: DNA ligasa forma el enlace fosfodiéster en la columna azucar fosfato La estabiliidad del DNA y PLT de los genes depende del mecanimos de REPARACION

- 50 proteinas distintas en reparación en levaduras xeroderma pigmentosum Cáncer de piel 06_26_three steps.jpg 06_26_three steps.jpg Que hayan 50 enzimas distintas es una inversion de muchos recursos PLT implica que el proceso es importante Xeroderma no reparan dimeros de T

Conservado a traves de la evolución: la replicación el proceso de reparación también Proteínas entre especies “distantes”: conservadas 06_27_humans_whales.jpg 06_27_humans_whales.jpg Los procesos de replicacion y de reparacion son conservados Cambios se acumulan bien lentamente Humanos y chimpances: 98% idénticos en algunas secuencias

Secuencias del DNA Secuencias únicas Secuencias repetitivas Genes estructurales (una sola copia) Secuencias repetitivas Muchas copias, dos tipos: Satélites de DNA Conglomerados en áreas discretas – centrómero  Repetitive Sequences in the Eukaryotic Genome Highly repetitive sequences are present in large numbers of copies

Secuencias repetitivas… Secuencias del DNA Secuencias repetitivas… “Mobile elements” Transposones – Se transportan directamente como DNA Elemento P y Abs y CENPB Retrotransposones – Se transportan a través de un RNA intermedio. RDDP SINES (short interspersed DNA) - Alu Dispersas por el cromosoma Regiones ricas en genes (G:C) LINES (long interspersed DNA) – L1 Regiones pobres en genes (A:T) Elementos mobiels – 45% del genoma humano : elementos discretos pequenos disperos en el genoma Se mueven o se movian por el genoma Dos Tipos Transposones - usan intermediario de DNA RetroTranspo – usan intermeiario de RNA

Retrotransposon Transposon DDRP mRNA RDDP DNA Intermedio

Mechanism of transposition of an L1 element DDRP RDDP RetroTranspo – usan intermeiario de RNA Fig. 12-5 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

Peligros – preferencia por regiones GC PLT Elementos móbiles Peligros – preferencia por regiones GC PLT Alterar Deleciones Rearreglos Alu el mutágeno endógenos mas potente (1/100 nac) “Selfish DNA hypothesis” No ofrecen ningun beneficio fisiológico Infeccion en el DNA que se tolera

Virología Molecular Ultramicroscópicos Pasaban filtros de bacterias No crecían en medio de cultivo convencional Parásitos intracelulares obligados: Genes dentro de cubierta o cápsula proteica Toman control de la maquinaria bioquímica de la célula Asignar recombiancion homologa Virus y tranposones

Virus: Definición Partícula Ácido nucleico Capa de proteínas Cápsula capsómeros Parásito celular obligado Pequeño Infeccioso virus: se le conoce como una partícula con las siguientes características: Propiedades definitivas!

Virus: Propiedades Parásito intracelular obligado Infeccioso Su genoma puede ser DNA o RNA Capaz de replicarse y dirigir la síntesis de proteínas utilizando la maquinaria del hospedero cuando se encuentra en el hospedero correcto. En Resumen: Propiedades de los virus: Parásito intracelular obligado Infeccioso-(Koch) aislarlo de la lesion, cultivarlo en medio apropiado, reinocularlo y causar la enfermedad, reaislarlo del organismo… Su genoma puede ser DNA o RNA Capaz de replicarse y dirigir la síntesis de proteínas utilizando la maquinaria del hospedero cuando se encuentra en el hospedero correcto. La progenie de los virus se ensambla “de novo” a partir de componentes sintetizados en la célula hospedera. Medio de transmisión El virus recién producido en la célula hospedera. Composición estructural simple Cristalografía – Wendell Stanley cristaliza el VMT Virus del Mosaico del Tabaco -1935 NO se sabia nada de cristalizacion de moleculas biologicas, Mas bien esto era relacionado a materia inorganica..... seria algo vivo? Fue su simplificada estructura y los arreglos regulares de sus muchas particulas

Virus: Propiedades La progenie de los virus se ensambla “de novo” a partir de componentes sintetizados en la célula hospedera. Medio de transmisión El virus recién producido en la célula hospedera. Composición estructural simple Cristalografía Virus del Mosaico del Tabaco -1935 En Resumen:

Virus: Alta Variabilidad en Configuraciones Genómicas 06_36_Viral genomes.jpg 06_36_Viral genomes.jpg

06_37_Viruses.jpg Genoma limitado por espacio codifica lo que necesita en menos espacio posible Estrategias variadas múltiples Dependencia del hospedero ATP Ribosomas … Quién vino primero? 06_37_Viruses.jpg 06_37_Viruses.jpg

06_38_Viral coats.jpg 06_38_Viral coats.jpg

06_39_retrovirus.jpg Retroviruses: Invierten el dogma central RT, DNApol, RNAsa H, Helic Integrasa

¿Preguntas? Propiedades definitivas Propiedades fun uybdamentales en la propagacion