(41) BASES MOLECULARES DE LA INGENIERIA GENÉTICA JOSE ROBERTO ALEGRIA COTO Depto. de Desarrollo Científico y Tecnológico ralegria@conacyt.gob.sv Sala de Junta Directiva CONACYT Miércoles 9 abril 2003 2:00 p.m.

CONTENIDO: Objetivos Introducción ADN recombinante Indicadores sobre Organismos Modific. Genéticamente (OMGs) Ejemplos de OMGs Reflexión final

OBJETIVOS: Presentar información con validez científica, en forma clara y comprensible. Contribuir a generar un ambiente propicio para la reflexión analítica sobre la Ingeniería Genética (Tecnología del ADN recombinante). Promover el espíritu crítico e identificar el potencial de la investigación biotecnológica para su aprovechamiento en beneficio del mejoramiento de la calidad de vida de los salvadoreños.

HECHOS HISTÓRICOS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR 1953 Watson & Crick determinación de estructura del ADN 1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana elucidaron Código Genético 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa 1970 Smith y Wilcox aislaron y caracterizaron Hind III 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias 1974 Demostración directa de delección génica humana 1975 Edward Southern Southern Blotting 1977 Chow & Roberts, Sharp Intrones-Exones ADN codificante 1978 Y. W. Kan & A. M. Dozy RFPL diag. prenatal, oncogenes 1980 Maxam-Gilbert & Sanger Métodos de Secuenciación 1982 Tabaco, la primera planta modificada genéticamente 1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas publican la secuencia del fago lambda 2000 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2001 26 de enero borrador genóma del arroz Oriza sativa

Anticuerpos Monoclonales . Marcadores Ingeniería Genética Tecnología del ADN Fármacos Anti-cáncer Diagnósticos Cultivo de Células Vegetales Transferencia de genes en animales Síntesis de Sondas de ADN Localización desórdenes genéticos Clonación Solución de crimenes BIOTECNOLOGÍA Producción de Proteínas humanas Terapia Génica Bancos de ADN, ARN Proteínas Mapas de Genomas completos Biología Molecular Cultivos Celulares Anticuerpos Monoclonales Síntesis de Nuevas Proteínas Nuevos Antibióticos Nuevas Plantas y Animales Alimentos Recursos humanos químicos raros BIOTECNOLOGÍA

BASES MOLECULARES DE LA VIDA ADN ADN ARN PROTEÍNAS genoma Célula cromosomas genes los genes contienen instrucciones para hacer proteínas ADN las proteínas actúan solas o en complejos para realizar las funciones celulares BASES MOLECULARES DE LA VIDA ADN ADN ARN PROTEÍNAS

GENOMAS IDENTIDAD GENÉTICA Todos los seres vivos tienen su información hereditaria codificada en la molécula de ADN. El juego completo de ADN de un ser vivo es el genoma. El genoma humano cuenta con 3 mil millones de pares de bases (pb) y unos 30,000 genes, que son un 3% del genoma. El tamaño del genoma es independiente de la complejidad del organismo. El Genoma de mayor tamaño es el del pez pulmonado africano Protopterus aethiopicus con 139 mil millones de pb; una planta con flores Fritillaria assyriaca tiene 124,900 millones de pb. GENOMAS 60% IDENTIDAD GENÉTICA De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila. 20% 70% 95% idéntico Humanos 30,000 genes Chimpancé 30,000 genes Ratón 30,000 genes A. thaliana 25,000 genes C. elegans 19,000 genes D. melanogaster 13,000 genes Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

COMPARACIÓN DE GENOMAS ESPECIES CROMOSOMAS GENES PARES DE BASES (MILLONES) HUMANO (Homo sapiens) 46 (23 pares) 28-35,000 ~ 3,100* RATÓN (Mus musculus) 40 22.5-30,000 ~ 2,700 PEZ SOPLADOR (Fugu rubripes) 44 ~ 31,000 ~ 365 MOSQUITO DE MALARIA (Anopheles gambiae) 6 ~ 14,000 ~ 289 CHORRO DE MAR (Ciona intestinalis) 28 ~ 16,000 ~ 160 MOSCA DE LA FRUTA (Drosophila melanogaster) 8 ~ 137 LOMBRIZ INTESTINAL (Caenorhabditis elegans) 12 19,000 ~ 97 BACTERIA (Escherichia coli) 1 (cromonema) ~ 5,000 ~ 4.1 En humanos, apróximadamente el 3% son secuencias codificantes (www.jgi.doe.gov)

ESTRUCTURA DE UN GEN Tradicionalmente, un gen se ha Molécula de ADN ESTRUCTURA DE UN GEN Tradicionalmente, un gen se ha definido como un segmento de ADN que codifica para un polipéptido o para una molécula funcional de ARN. Recientemente, los nuevos descubrimientos han alterado radicalmente esta visión, para adoptar una definición más vaga. De acuerdo con ello, un gen es una secuencia de ADN genómico o de ARN que es esencial para especificar una determinada función. Para llevar a cabo su función el gen no necesita ser traducido a proteína, y a veces ni siquiera necesita ser transcrito.

ESTRUCTURA DE UN GEN Elementos típicos: 1) región reguladora promotor basal (caja TATA). sitios de unión de proteinas reguladoras (upstream promoter). Realzadores (enhancers) Silenciadores 2) sitio de inicio de transcripción. 3) 5'UTR. 4) codón de inicio. 5) intrones y exones alternados, con sitios de procesamiento aceptores y donadores 6) Codón de paro. 7) 3'UTR. 8) señal de poli-adenilación. (Gomez, M. & R. Alonso-Allende, CSIC)

ESTRUCTURA GENÓMICA DE GENES Región cromosómica del gen ADAM33. (a) estructura genómica de genes a los lados de ADAM33 (barra 15 kb). (b) Estructura exon intron de ADAM33 (barra 1 kb). Polimorfismos de nucleótidos únicos SNPs se indican abajo del gen. (c ) Organización del Dominio del gen ADAM33 y localización de SNPs 3’UTR Codificantes. Tamaño de exones en pares de bases (pb) (Kreeger, Y. The Scientist apr. 2003).

INGENIERÍA GENÉTICA O ADNr La Ingeniería Genética o tecnología del ADNr se inició en la década de los 70s. Se refiere a un grupo de tecnologías usadas para cambiar la composición genética de las células y mover genes a través de las fronteras de las especies para producir nuevos organismos. Se pueden aislar genes, modificarlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE (ADNr) PROPÓSITO Enzimas Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN ADN Ligasa Une fragmentos de ADN Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación Plasmidos Clase común de vector Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas ADNc Copia de ADN a partir de ARN mensajero Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia Síntesis Génica Para hacer un gen de una base de datos Gel Electroforésis Para separar fragmentos de ADN Secuenciación ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

Transcriptasa reversa TÉCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS PARA LA MANIPULACIÓN DEL ADN Enzimas de restricción ADN polimerasas ARN polimerasas Nucleasa ADN ligasa Kinasa Fosfatasa Transcriptasa reversa

DE TRANSFERENCIA GENÉTICA Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA 1. Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Genético". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética. 2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula. 3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópi-cas, que atraviesan las membranas con los insertos.

DE TRANSFERENCIA GENÉTICA Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA 6. Microinyección. Una célula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN foráneo es inyectado directamente en el núcleo usando una micropipeta muy fina. Se usa cuando hay pocas células disponibles, tales como células fertilizadas de huevo animal. 7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeñas vesículas de membrana para introducir el ADN in vivo en la célula.

DE TRANSFERENCIA GENÉTICA Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con puntas de 1μm de diámetro, bajo la guía de un microscopio para inyectar ADN directamente en cloroplastos. Dichas puntas finas no dañan la membrana del cloroplasto, pero es requerida una alta presión para sacar el ADN de la aguja. El control del flujo de ADN bajo alta presión es un problema práctico significativo, que ha sido superado introduciendo un metal líquido en la aguja atrás del ADN. Cuando la aguja es calentada el metal se expande forzando al ADN a salir de manera controlada. Los investigadores también han usado esta misma técnica para introducir ADN en bacterias individuales y núcleos de células eucarióticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).

COMPARACIÓN ENTRE HIBRIDIZACIÓN CLÁSICA Y LA TRANSGÉNESIS PUNTOS DE COMPARACIÓN HIBRIDIZACIÓN CLÁSICA TRANSGÉNESIS Número de genes transferidos Una docena de millares de genes para encontrar el gen de interés Uno o varios genes de interés en una construcción genética Elección de la característica a transmitir Se limita a la compatibilidad sexual (confinada al interior de una especie) En principio ilimitada (franquea la barrera de las especies) Tiempo para estabilizar la nueva variedad 10 a 20 años o más 3-4 años (Counseil de la science et de la technologie, 2002).

MODELOS ANIMALES Y VEGETALES Ingeniería Genética: MODELOS ANIMALES Y VEGETALES Los ANIMALES son: Caenorhabditis elegans (100 millones pb, 19,000 genes, Drosophila melanogaster (165 millones pb) Mus musculus (3 mil millones pb, 30,000 genes) Sus scrofa (2 mil 700 millones pb) Los VEGETALES son: Arabidopsis thaliana (100 millones pb) Nicotiana tabacum Orizae sativa (400 millones pb) Solanum tuberosum Blom, N. & Rapacki K. www.dur.ac.uk/biological.sciences/Bioinformatics/dogs.htm

En el año 2000 se cultivaron en el mundo 44,2 millones de ha de PRIMERA GENERACION de cultivos transgénicos. $ 2.1-$ 2.3 miles de millones 1999 Plantas transgénicas Sup. cult. millones ha. % cultivos transgén. % producc. total plantas 27.8 millones de ha 1998 Soya 25,8 58,4 36 Maiz 10,3 23,3 16 Algodón 5,3 12 11 Colza 2,8 6 7 TOTAL 44,2 99,7 16 NATURALEZA DE LA MODIFICACIÓN GENÉTICA 7% 19% 74% (Counseil de la science et de la technologie, 2002).

INDICADORES: CULTIVOS TRANSGÉNICOS POR PAÍS 1999 2000 % de Cambio PAÍS EN MILLONES DE HECTAREAS, 1996 A 2000 PAÍS 1999 2000 % de Cambio Estados Unidos 28,7 30,3 +5,6 Argentina 6,7 10,0 +49,3 Canada 4,0 3,0 -25,0 China 0,3 0,5 +66,7 Africa del Sur 0,1 0,2 +100 Australia Otros <0,1 - TOTAL 39,9 44,2 +10,8 (Counseil de la science et de la technologie, 2002).

INDICADORES: LIBERACIONES U.S. OMGs (17 marzo 2003) (desde 1987) Organismos regulados con al menos 10 liberaciones Número de liberaciones APROBADAS bajo permiso y notificaciones Maíz (4045) Papa (715) Frijol de soya (639) Algodón (591) Tomate (523) Trigo (282) Tabaco (208) Colza (173) Alfalfa (160) Arroz (142) Hierba rastrera (139) Remolacha (136) Melón (132) Lechuga (74) Álamo (67) Calabaza (60) Caña de azúcar (41) Fresa (40) Cebada (33) Uva (33) Manzana (32) Girasol (32) Chícharo (29) Pepino ( 25) Grama azul de Kentucky (24) Maní (24) Brassica oleracea (18) Pino (17) Arabidopsis thaliana (16) Papaya (16) Petunia (16) Ocozol (16) Pseudomonas syringae (14) Zanahoria (13) Pasto San Agustín (13) Pimienta (12) Nogal (12) Pasto Bermuda (10) VMT (10) Sandía (10) Organismos APROBADOS (categoría FENOTIPOS) Número TOTAL de liberaciones APROBADAS bajo permiso y notificaciones Tolerancia a herbicidas (2864) Resistencia a insectos (2714) Calidad del producto (1772) Resistencia a virus (1196) Propiedades agronómicas (709) Resistencia a hongos (561) Otros (454) Genes marcadores (393) Resistencia a bacterias (99) Resistencia a nemátodos(10) www.isb.vt.edu Regulatory Information Charts for Field Test Releases in the U.S.

CHINA ENCABEZA LA REVOLUCIÓN DE OMGs La investigación en cultivos de plantas genéticamente modificadas para alimentación, está detenida en muchas partes del mundo. En China las políticas están promoviendo el aumento de capacidad de la Biotecnología Vegetal. Los investigadores trabajan con más de 50 especies de plantas, que incluyen (arroz, trigo, papas y mani) y con más de 150 genes funcionales. El AlgodónBt creciendo en China ha reducido el uso de pesticidas, incrementado la eficiencia de la producción y ha mejorado la salud del agricultor (Science,295, 674 (2002).

ANIMALES ACUÁTICOS TRANSGÉNICOS Especies Transgenes Países Ctenopharingodon idella carpa triploide de grama Cyprinus carpio carpa común Carassius auratus pez dorado, goldfish Pez de Wuchang / Charr del artico / Mummychog / Walleye Pangio kuhli locha gigante / Esox lucio lucio del norte Oncorhynchus mykis trucha arcoiris, O. kisuth salmón Salmo salar salmón del Atlántico Oreochromis spp tilapia Artemia spp pulga de agua Macrobrachium rosenbergii camarón de agua dulce Penneus indicus camarón blanco Haliotis kamtschatkana abalón japones Haliothis rufescens abalón rojo Mytilus edulis almeja azul Crassostrea virginica ostra oriental Crassostrea gigas ostra del Pacífico Genes marcadores Hormona de crecimiento Polipeptido anticongelamiento Cecropina Interferon Fitasa Factor VII de coagulación humana Genes reporteros para contaminantes GnRH antisentido (liberación Hormona Gonadotropina) USA Canadá Cuba Reino Unido Francia Noruega China Japón Corea India Israel Hallmark, E. 2003, ISB News Report, april

ARROZ DORADO con beta caroteno de Ingeniería Genética: NUEVOS ALIMENTOS ARROZ con enzima lactoferrina de leche humana, que puede ser utilizada para mejorar las fórmulas de leche infantil. Los niños la necesitan para usar eficientemente el hierro y pelear contra las infecciones (Pearson, H. Nature, 26 april 2002). ARROZ DORADO con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en pro- vitamina A al ser ingeridos. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina. ARROZ con aa esenciales (ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

Ingeniería Genética NUEVAS PLANTAS ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condiciones ambientales de estrés. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa de E. Coli y un promotor tejido específico dependiente del estrés. Los genes de trehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado por frio, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producción en 20%. El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés. La composición química de los granos no cambia (PNAS Online, 27 nov. 2002).

Ingeniería Genética: NUEVOS ALIMENTOS Salmón transgénico por hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. Cuenta con el promotor de la proteína de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un salmón no transgénico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversión del alimento. (ISB, 2001, oct; Netlink, 2000). VACAS LECHERAS con incremento de proteínas. En Nueva Zelanda se clonaron vacas con óvulos mejorados genéticamente, para mejorar la producción del queso y crema, aumentando dos veces la kappa caseína, crucial para hacer la cuajada y de 20% más de beta caseina, que mejora la acción del cuajo (Hoag, H. Nature, 27 enero 2003).

MÉTODOS ANÁLITICOS PARA DETERMINAR TRANSGÉNESIS FENOTIPO PROTEÍNAS ÁCIDO NUCLÉICO MUESTRA Semilla, Plántula Planta, sub- prod. tej. esp. Planta, sub- prod. tej. esp. DURACIÓN Días, semanas meses Horas, 2-3 días 2-3 días SENSIBI- LIDAD Poco sensible (manual) Sensible (ELISA) Muy sensible (PCR) COSTO Barato Caro, US $ 10 muestra Muy caro, US $ 200 muestra (Rivera B., F. Huatulco 2001)

El Salvador y el Siglo XXI En el nuevo siglo, hay una nueva era de la C&T, nos preguntamos: ¿Podrá El Salvador, apropiarse de los conocimientos de la Biotecnología para resolver la necesidad de alimentar adecuadamente a su creciente población? ¿Usaremos la Ingeniería Genética para modificar plantas que toleren la sequía y la salinidad de las tierras o que tengan una mejor calidad alimenticia? Y ¿Seremos capaces de preparar los recursos humanos, que aprovechen los conocimientos derivados de la Convergencia Nanotecnológica (Tecnología de la Información, Biotecnología, Nanotecnología, Ciencias del Conocimiento), en beneficio del país?

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