Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal. Formas de actuación mediante terapia génica. Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular. Enfermedades candidatas para un tratamiento con terapia génica.

¿QUÉ es la Terapia génica? “Proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo para producir un efecto terapéutico.” DNA como medicamento o Curar con genes

¿QUÉ es Gene Marking? “Proceso que utiliza técnicas comunes a la Terapia Génica pero sin buscar un efecto terapéutico.” Ej. Seguir la pista a determinadas células en el organismo.

“Añadir función” Terapia Génica “Suprimir función”

“Añadir función” Terapia Génica

Añadir función Sustitución del gen deseado. Reparación de una mutación. Añadir un gen

Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual) Añadir función Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual) Introducción del transgen al azar (añadir un gen)

Terapia Génica “Suprimir función”

Suprimir función Muerte celular (suicidio de las células) Oligonucleótidos antisentido (expresión). Ribozimas (Ruptura).

OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO iRNA: RNA de interferencia

MODOS DE INTRODUCCIÓN

“In vivo” Terapia Génica “Ex vivo”

IN VIVO/EX VIVO EX VIVO DIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES EX VIVO SOLO EN CULTIVOS CELULARES

IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo DIRECTOS EX VIVO

DNA desnudo Inyección de la molécula de DNA. Músculo , Piel, Mucosas y Timo. Introducción por “nuclear pore complex”. Talla ILIMITADA. Bajo porcentaje de transfección No hay integración en el genoma. No hay amplificación del DNA.

IN VIVO/EX VIVO EX VIVO DNA desnudo DIRECTOS INDIRECTOS - Mediados por vectores EX VIVO

¿Qué es un vector? “Son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de un gen exógeno a la célula, facilitando la entrega, biodisponibilidad intracelular del mismo de modo que pueda funcionar correctamente”

Características del vector ideal Especificidad de órgano o tejido. Protección del DNA. Elevada disponibilidad. Expresión eficaz. No inmunógeno/sin repuestas inflamatorias. Seguro paciente/entorno.

IN VIVO/EX VIVO EX VIVO DNA desnudo DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos INDIRECTOS EX VIVO

VECTORES RETROVIRALES Una cadena de RNA. Protegidos por una cápside. Talla de 80 a 130 nm. Tres genes importantes: gag: proteínas de la cápside pol: transcriptasa inversa e integrasa Env: proteínas de envoltura y reconocimiento de receptor Zonas LTR: Long Terminal Repeat

LTR----GAG/POL--ENV----LTR LTR----PROMO+GEN----LTR Construcción Retroviral LTR----GAG/POL--ENV----LTR LTR----PROMO+GEN----LTR MMLV: Moloney Murine Leukemia Virus

Producción de vectores retrovirales CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free) -------GAG/POL--ENV------- RNA LTR---GEN---LTR

Producción de vectores retrovirales CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free) Retrovirus Recombinantes

Características de los vectores retrovirales Alta eficacia de transducción. Tamaño del inserto 8Kb. Alta expresión una vez introducido en el genoma. Sistema muy bien estudiado. Proteínas del vector no se expresan en el huésped. Necesita células en división. Se consiguen títulos muy bajos de virus. Integración al azar en el genoma. Transducción “in vivo” poco efectiva.

IN VIVO/EX VIVO EX VIVO DNA desnudo DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos INDIRECTOS EX VIVO

VECTORES ADENOVIRALES DNA lineal de cadena doble. Más complejos que los retrovirus. Tres genes importantes: E1: rescata células de la quiescencia. E2: proteínas relacionadas con la replicación del DNA. E3: defensa ante el sistema inmunitario. E4: regulación de la transcripción. VIRUS RECOMBINANTES E1 Y E3 ELIMINADOS

Fácil producción en el laboratorio. Gran respuesta inmunitaria. Características de los vectores adenovirales Eficaces a la hora de transferir el gen episomal a una gran cantidad de células. Fácil producción en el laboratorio. Gran respuesta inmunitaria. Dificultad para repetir la inyección de virus.

IN VIVO/EX VIVO EX VIVO DNA desnudo DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos INDIRECTOS EX VIVO

VECT. ADENOASOCIADOS DNA lineal de cadena doble. Se insertan en el genoma. Dos genes : rep: replicación e integración del virus. cap: tres proteínas estructurales víricas. TR: repeticiones terminales-145 nucleótidos. VIRUS RECOMBINANTES SOLO CONTIENEN TR Células que poseen los genes rep y cap.

Expresión a largo plazo. No hay respuesta inmunitaria. Características de los vectores adeno-asociados Expresión a largo plazo. No hay respuesta inmunitaria. Talla limitada del gen a introducir (aprox 5 Kb). Dificultad para obtener grandes cantidades.

http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

IN VIVO/EX VIVO EX VIVO DNA desnudo DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos INDIRECTOS EX VIVO

POSIBILIDAD DE UNIR RECEPTORES LIPOSOMAS CATIÓNICOS Su carga positiva reacciona con la negativa del DNA formando un complejo. pH SENSIBLE O ANIÓNICO Mediante una desestabilización por bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”. POSIBILIDAD DE UNIR RECEPTORES ESPECÍFICOS

Características de los liposomas Protegen al DNA No hay limite de tamaño Enviar a lugares específicos. Baja eficacia Expresión transitoria. Toxicidad celular Inhibición por componentes séricos.

IN VIVO/EX VIVO EX VIVO DNA desnudo DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos INDIRECTOS EX VIVO Precipitación con fosfato de calcio QUIMICOS Electroporación FISICOS

MÉTODOS “EX VIVO” (Cultivos celulares) Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el enfermo

MECANISMO “EX VIVO”

MODO DE INTRODUCCIÓN

Algunas... Enfermedades monogénicas. Cancer. Enfermedades infecciosas o parasitarias. Enfermedades neurodegenerativas

Enfermedades Monogénicas - Conocidas por la mayoría como las únicas candidatas para el tratamiento. - Aporte de la proteína/enzima deficitaria. - Posibilidad de realizar terapia génica germinal..

Algunas... Deficiencia Inmune Severa Combinada Deficiencia Inmune Severa Combinada ligada al cromosoma X Fibrosis Quística Enfermedades lisosomales (Gaucher, etc.)

Deficiencia Inmune Severa Combinada - Deficiencia en la enzima Adenosin Desaminasa. - 1/100.000 (25% de mortalidad). - Fragilidad de los linfocitos T.. INMUNOSUPRESION

David "niño burbuja", (Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)

- Aportación de la enzima recombinante: ADA PEG-ADA Tratamientos - Aportación de la enzima recombinante: ADA PEG-ADA - Transplante de médula osea.

1ª Experiencia de Terapia génica: Deficiencia Inmune Severa Combinada - 1990. Dr Blaese (EEUU) Dr. Bordignon (Italia) -1995 Demuestran la eficacia del tratamiento

Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad. (Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada -Mutación en el Cromosoma X - Deficiencia en la cadena g del receptor para la interleukina IL2RG - Hospital Necker de Paris (11 niños)

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada 3 de los niños sufrieron una leucemia. ¿Por qué? Efecto posición (LMO2)-2003 Efecto sobreexpresión- 2006

- Deficiencia en el CTFR (Cystic factor transmembrane receptor). Fibrosis Quística - Deficiencia en el CTFR (Cystic factor transmembrane receptor). - 1/2.800 (Muerte a los 29). - No hay tratamiento. Problemas para clonar el CTFR

2.-Tumores Los más tratados: Melanoma. - - Muerte celular - Genes supresores de tumores. - Producción de linfoquinas - Inmuno Terapia con antígenos MHC Los más tratados: Melanoma. Leucemias Glioblastoma Tumores de pulmón, hígado, etc.

3.- INFECCIOSAS Y/O PARASITARIAS - - Estimular el sistema inmunitario. - Vacunas de DNA desnudo con antígenos. - Linfocitos recombinantes para los anticuerpos que actuan contra el virus. Algunos ejemplos: SIDA Vacunas de DNA desnudo en animales.

4.- Enfermedades neurodegenerativas - - Inhibición de apoptosis neuronal. - Producción de L-dopa o factores neurotróficos en cerebro. Algunos ejemplos: Enfermedades de la motoneurona (E.L.A. Y E.M.) Parkinson y Alzheimer.

ENFERMEDADES TRATADAS

¿FASES?

¿Dónde se están tratando?

CIFRAS POR PAISES

CIFRAS POR CONTINENTES