Transferencia de material genético II Aislamiento de plásmidos

Objetivos Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA Realizar el aislamiento de DNA plasmídico

Estructura del ADN James Watson y Francis Crick en 1953 demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.

DNA

DNA La extensión de DNA que tiene cada organismo no es la misma. El DNA a pesar de su extensión tiende a formar una estructura helicoidal compacta.

Estructura del DNA Doble hélice Estabilizada por puentes de hidrógeno En la célula generalmente superempacada o superenrollada

Conformaciones de un plásmido Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

Conformaciones distintas del DNA: Superenrollamiento

Pero como vemos el superenrollamiento? Abierto Relajado Superenrollado El superenrollado es más compacto y por tanto migra más rápido en el gel

¿Cómo afecta el superenrollamiento del DNA a la función de la célula? Induce cambios locales en el DNA que desestabilizan la doble cadena y esto afecta la transcripción o cambia la unión de proteínas al DNA. Induce cambios globales en el DNA, los cual hace que secuencias de DNA distantes se acerquen y facilita la compactación del DNA y la recombinación sitio específica

Puentes de hidrógeno en el DNA DNA estructura helicoidal Estructura estabilizada por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (A=T; G≡C) Superenrollamiento Desnaturalizar- Renaturalizar: Romper y rehacer puentes de hidrógeno

DNA se puede desnaturalizar Calor, pH,↑ iones se eliminan sus puentes de hidrógeno.

EFECTO HIPERCRÓMICO Al monitorear su absorbencia a 260 m se observa que hay un aumento en está conforme alteramos o despegamos la doble hélice EFECTO HIPERCRÓMICO

Tm Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.

La re-naturalización El DNA se puede volver a re- naturalizar. Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto. De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.

Obtención del plásmido Paso 1: Lisis celular Generalmente se realiza con detergentes lleva detergentes para solubilizar la membrana

Obtención del plásmido Paso 2: Precipitación de proteínas y desnaturalización del DNA Se perturban los puentes de hidrógeno entre cadenas Se añade generalmente NaOH

Obtención del plásmido Paso 3: Renaturalización del DNA Se neutraliza el pH de la solución y se renaturaliza el DNA, PERO NO TODO!!!

Fundamento Lisis alcalina Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas.

Continuación... Paso 4: Separación del DNA cromosomal del DNA plasmídico y su purificación El DNA cromosomal está agregado y al centrifugar se queda en el botón El DNA renaturalizado se queda en la solución, el sobrenadante

El experimento

Cuantificación Una vez que se tenga el plásmido purificado entonces: Correr una muestra en un gel de agarosa Medir la absorbancia a 260 nm. Estimar la concentración. Guardar a –20°C para usar en la próxima sesión

Siguiente sesión experimental Continuamos con: Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con enzimas) Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox 45 min) Inducción de proteína recombinante (Alcanzar DO 0.6 en 1.5h; inducción 1.5h) Corrimiento electroforético: Gel de poliacrilamida (45 min) Siguiente sesión experimental

Preparación de un gel de agarosa para el corrimiento electroforético del plásmido y los productos de restricción