Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Bioquímica Clínica Química Biológica Patológica Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Bioquímica Clínica Tema 2  Dra. Silvia Varas tecmol@gmail.com

Tema 2 PCR Historia Bases Optimización de una reacción de PCR

APLICACIONES DE PCR MUTAGENESIS RT-PCR PRODUCCION DE SONDAS DETECCIÓN DE INFECCIONES BACTERIANAS Y VIRALES DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS ESTUDIOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR ESTUDIOS DE MEDICINA FORENSE ESTUDIOS DE FILIACIÓN

Un poco de historia…

20-25 años de la revolucion PCR!

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): no fué un descubrimiento pero fué mas que una invención Una ADN polimerasa especial (Taq) es usada para hacer muchas copias de una corta longitud de ADN (0,1-10 Kb) y que esta definida por cebadores o primers Kary Mullis, el inventor de la PCR fue premiado en 1993 con el Premio Nobel en Química 7

Camino Biotecnológico Steamboat Geyser: Thermus aquaticus Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock Biotechnology in Yellowstone © 1994 Yellowstone Association for Natural Science http://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27 En el año 1960, el microbiólogo Dr. Thomas Brock viaja al Parque Yellowstone National (Wyoming) para investigar a los microorganismos termófilos que viven en el calor de los géiser. El descubrió una bacteria de la especie de la Eubacterias que vivía a altas temperaturas en los géiser Barco de vapor (Steamboat Geyser) del parque: Thermus aquaticus En 1976 se purificó la Taq DNA polymerasa desde Thermus aquaticus. En 1983 la empresa Cetus Corporation patentó la técnica y el uso de la enzima DNA polimerasa de Thermus aquaticus y sentó las bases para el desarrollo de esta tecnología Hubo en paralelo un desarrollo de un blocks de calentamiento programables (termocicladores)

Termocicladores para PCR

CUIDADOS!

El principal agente contaminante es el usuario! Separación Física: Estructura de un laboratorio de biología molecular (PCR) El principal agente contaminante es el usuario! Área 2 Área 1 Área 3 Área 4 Pre-PCR Post-PCR Preparación de los reactivos Preparación de las muestras Amplificación de las muestras (PCR) Detección de los resultados Material Contaminante

Separación Física :Estructura de un laboratorio de biología molecular (PCR) Área 1 Preparación de los reactivos Prohibida la entrada de toda fuente de ADN. Alicuotar los reactivos Preparar mezclas de reacción. Almacenamiento dentro del área. Uso de gabinetes con UV. Área 2 Preparación de las muestras Uso de kits para minimizar manipu-lación. Almacenamiento dentro del área. Uso de gabinetes con UV o flujo laminar. Área 3 Área 4 Amplificación de las muestras (PCR) Detección de los resultados Disminuir la formación de aerosoles: Centrifugar antes de abrir los tubos Abrirlos con cuidado Pipetear con cuidado Si se requiere re-amplificar: Limpieza de las cubas (depurinación con HCl 1N) Cubrir transiluminador con un film

Contaminación: Riesgos y Mecanismos Cuando la PCR se realiza en un laboratorio común(sin sala separadas para cada etapa). No existe un conjunto de pipetas dedicadas a cada etapa (preparación, PCR, análisis). Uso de material no estéril o contaminado. Formación de aerosoles (pipeteo o centrifugación). Contaminación humana (secreciones, saliva, cabellos, etc.) Arrastre de muestra o carryover.

Control de Contaminación Buenas prácticas de laboratorio Movimiento unidireccional (no transportar elementos de post a pre PCR). Uso de elementos específicos para cada área. Uso de consumibles de alta calidad Uso de tips con filtro o de desplazamiento positivo. Evitar el uso de baños de agua o de hielo.

El ciclo de amplificación de PCR Cada ciclo requiere tres pasos de temperaturas para completar un ronda de la síntesis de ADN.

PCR: cinética primers DNA producto nº ciclos

El  perfil de  temperatura de un ciclo de PCR es controlado por el programa del termociclador. Hay un incremento exponencial del producto de PCR hasta cerca del ciclo nº 30.

PCR: cinética primers DNA producto Actividad Enzimática nº ciclos

PROCEDIMIENTO…..

PCR: PRINCIPIOS

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) PCR es una técnica la cual es usada para amplificar un numero de copias de una región especifica del ADN hasta producir una cantidad de ADN que sea adecuadamente testeada. El propósito de la PCR es hacer un alto número de copias de un gen. Como resultado es posible y caracterizar fragmentos de ADN hallados en una gota de sangre, en una escena de crimen o de un dinosaurio extinguido.

Definición PCR es un sistema no celular de clonado del ADN Es un método de amplificación selectiva de secuencia específicas. A partir de una población heterogénea de moléculas, como puede ser ADN genómico o cDNA. PCR es un proceso de replicación in vitro.

Ventajas y Desventajas Rapidez Sensibilidad Fortaleza DESVENTAJA DE PCR COMO METODO DE CLONADO: Se debe conocer la secuencia Producto generalmente pequeño Infidelidad de la replicación del ADN

CONCEPTOS BASICOS: EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE AMPLIFICACION EN FUNCION DEL NUMERO DE CICLOS ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO PRODUCTO DE AMPLIFICACION FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA DNA POLIMERASA DURANTE LA COPIA SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE NECESITA PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE COPIAS

Eficiencia de una PCR Especificidad Rendimiento Fidelidad

Fidelidad vs Eficiencia Infidelidad: Errores cometidos por la enzima: Taq pol 1 error / 2x104 pb incorporadas Tli pol (Thermococcus litoralis) 1 error/ 4x105 pb incorporadas Pfu pol (Pyrococcus furiosus): 1error/ 7x107 pb incorporadas In vivo ADN polimerasa: 1 error/ 3x109 pb incorporadas Eficiencia: 88 % 70% 60% Tiempo de extensión: Taq polimerasa: 2 Kb/min Tli polimerasa: 1 Kb/min Pfu polimerasa: 0.5 Kb/ min Procesividad fidelidad eficiencia

PCR En un tubo de PCR con una mezcla de DNA genómico, DNA polimerasa, buffer, nucleósido trifosfatos y primers Termociclador

Nomenclatura Hebras de ADN ! Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! 5’ 3’ 3’ 5’ Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-)

Paso 1: Desnaturalización del DNA Esto ocurre a 92-95 ºC

Paso 2: Annealing o Unión de Primers Reverse Primer Forward Primer Los cebadores se unen a la secuencia complementaria sobre DNA target.

Paso 3: Extensión o “Primer Extension” 5’ 3’ extension extension 3’ 5’ DNA polimerasa cataliza la extensión de la hebra en sentido 5’3

El nuevo ciclo se inicia por desnaturalización de las nuevas hebras formados en el ciclo previo.

El tamaño del fragmento producido en PCR depende de los primers Reverse primer Forward primer Tamaño de los fragmentos que son amplificados

Elementos de una PCR especifica Templado Enzima Iniciadores Temperatura de anneling Concentración de Magnesio Concentración de Nucleótidos Condiciones del medio: Buffer, pH, etc. Aditivos: Formamida, DMSO, glicerol, etc. Calidad Concentración Secuencia Concentración, pureza y estabilidad

1)Templado ADN genómico CALIDAD: CONCENTRACION: 10pg-1μg Templados: Sangre, sangre seca, exudado vaginal, cabellos, frotis nasofaríngeo, etc.

2) Enzima

DNA Polimerase de Taq (Thermus aquaticus ) Esta enzima tolerante al calor y sobrevive a los distintos ciclos de desnaturalización

Acción DNA polimerasa I

DNA polimerasas termoestables: características Procesividad: Actividad de polimerasa 5’3’ actividad de síntesis Fidelidad: Actividad 3’5’ exonucleasa (correctora) Actividad de Transferasa Terminal: Agrega un nucleótido de adenina (A) en extremo 3’. (-) actividad transferasa teminal: extremos romos 5’ 3’ A

La actividad 3'5’ exonucleasa remueve en posición 3’ todo nucleótido mal apareado (Realiza una función de lectura de prueba) (proofreading) La actividad 5'3’ exonucleasa desplaza nucleótidos por delante de la adición por la actividad polimerasa

La función 3’5’ exonucleasa La función 3’5’ exonucleasa de la DNA polimerasa I. Esta actividad enzimática escinde los nucleótidos mal apareados desde el extremo 3’ de la hebra azul que esta creciendo

In vivo 1 base en 3x109nt es copiado incorrectamente La actividad 3'5’ exonucleasa (proofreading) In vivo 1 base en 3x109nt es copiado incorrectamente

Diferencias entre 2 polimerasas Taq Mas rápida (200nt/min) Menos de 1h a 95ºC Pfu Más lenta (500nt/min) Vida media 18-25h a 95ºC-98ºC  GC Velocidad de síntesis Termoesta-bilidad

3) Elección de los Primers o Iniciadores I Tamaño: generalmente cerca de 20 nt. Si son muy largos problemas annealing y inespecificos. Tº de anneling semejante Tm= 4(G+C) + 2 (A+T) ºC Evitar repeticiones, buscar regiones con una distribución homogeneas de bases Contenido de GC (40-60%) Elección de primers para cDNA

3) Elección de los Primers o Iniciadores II Elegir iniciadores con residuos G o C en 3’ o en la zona central Evitar secuencias complementarias en el extremo 3’ Evitar secuencias que formen estructuras secundarias. CONCENTRACION : 20-50 pM/ul Proporción molecular: Iniciadores/ADN molde = 108:1 Si es  disminuye la eficiencia Si es  disminuye el rendimiento

3) Primers o Iniciadores: Resumen Específicos de la secuencia de interés Longitud 18-30 nucleótido Tº Annealing 50oC-70oC Idealmente 58oC-63oC GC contenido 40-60% Extremo 3’ critico G o C en extremo 3’ terminal aumenta la eficiencia de la reacción. Secuencia Complementarias entre si mismas y con otros Hairpins <5, dimers <9

Se debe evitar: Secuencias complementarias entre primers Secuencias complementarias dentro del mismo primer

4) Temperatura de anneling Temperatura de Annealing: Tmprimer = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] –273.15°C + 16.6 log 10 [K+] H:entalpia, S entropia para la formación helix; R constante molar y c es la concentración primer Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC Para 18–24 bases ~ 5oC menos que la Tm de los primers  en la tº anneling resulta en una union no-específica. en la tº annealing resulta en reducción en el rendimiento

G:·3 ; A: 11 C:5 ; T: 7 TOTAL= 26 nt Tm= 4.8+2.18=32+36=68ºC

Efecto de la temperatura de anneling vs rendimiento y especificidad  Los pares de primer o cebadores 1 y 2 generan altos niveles del producto de PCR correcto a 55ºC. Sin embargo el par 3 de cebadores funciona mejor a 50ºC.

RESUMEN: LONGITUD DE 18 a 24 nucleótidos ESPECIFICOS Tm = 55 a 75 C, CON Tm SIMILARES ENTRE SI DISEÑAR PRIMERS CON CANTIDAD APROXIMADAMENTE 50% DE GC Y DISTRIBUCION AL AZAR EVITAR PRIMERS CON SECUENCIAS DE POLIPURINAS Y/O POLIPIRIMIDINAS (Poly GC: DISMINUYE ESPECIFICIDAD - Poly AT: DISMINUYE EFICIENCIA) EVITAR SECUENCIAS QUE FORMEN ESTRUCTURAS SECUNDARIAS CONTROLAR QUE LOS PRIMERS NO HIBRIDICEN ENTRE SI EVITAR MAS DE 3 CG SEGUIDAD EN EL EXTREMO 3´ COMENZAR Y TERMINAR CON PURINAS EXISTEN PROGRAMAS PARA DISEÑO DE PRIMERS

Rol de los iones metálicos Mg+2, se une en el sitio activo de la ADN polimerasa. Los iones de metal A activa grupo 3-OH grupo del primers para el ataque nucleofílico (flecha) en el grupo -fosfato del nucleótido entrante (en este caso, ddCTP). El ión metálico orienta y estabiliza electrostáticamente el grupo trifosfato cargado negativamente de DNTPs. Los átomos están coloreados de acuerdo al tipo (C: gris, N: azul, O:rojo y P: amarillo), y la coordinación de iones metálicos se representa por líneas de puntos verdes.

5) Concentración de Mg2+ Importante para la actividad de la enzima. Debe hacerse una curva de titulación 1-3 mM con incrementos de 0,5mM. MgCl2: se requiere para la unión del primer

5) Concentración de Mg2+ - II MgCl2 afecta la union de los cebadores, Tm del templado del ADN, actividad de la enzima y fidelidad Los dNTPs, cebadores y el templado quelan y secuestran ion Mg  su concentración debe ser mayor que los dNTPs Exceso de Mg2+ aumenta la inespecificidad Pequeñas cantidades de Mg2+ reduce el rendimiento

6) Concentración de dNTPS Debe variar según el tamaño de la secuencia target a amplificar. Por ejemplo: para un rendimiento de 1012 moléculas de 100pb, se necesitan 1014 moléculas. Generalmente la mix que se prepara son de 2-2,5 mM

7) Mezcla de reacción El buffer, pH y concentración de Mg2+ óptimos de acuerdo a la secuencia y al par de iniciadores elegidos Uso de estabilizantes de la enzima: gelatina, Tritón X-100, Tween 20, BSA Elementos que facilitan la desnaturalización del ADN molde: glicerol, dimetilsulfóxido y formamida

7) Mezcla de reacción II La mayoría de los buffers tienen KCl (50mM) y Tris (10mM): Estas concentraciones pueden ser alteradas, KCl facilita la unión de los cebadores pero a concentraciones 50mM inhiben la Taq Los buffer pueden tener: DMSO, BSA, gelatina, glicerol, Tween-20, Nonidet P-40, Triton X-100, DTT.  la especificidad de la reacción pero tambien pueden ser inhibitorios.

Coadyuvantes: BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no especifícos Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (templado ricos en GC) DMSO: Ayuda la elongación en templados ricos en GC Mezcla de polimerasas Hot start

8) Típica reacción de PCR: El

Optimización: número de ciclos El tiempo de vida media de Taq es de 30 minutes a 95oC Si se usa mas de 30 ciclos con un tiempo de desnaturalización de 1 minuto, la eficiencia de la Taq será menor. No caer en la fase de Plateau

Rendimiento Teórico = 2n Por ej.. ciclo 1 = 2, ciclo 2 = 4, ciclo 3 = 8, etc Ej. Si Ud. inicia la PCR con 100 copias después de 30 ciclos obtendrá 1.073.741.800 copias

Amplificación Exponencial Ciclos Copias 1 2 4 16 10 1.024 15 32.768 20 1.048.576 25 33.554.432 30 1.073.741.824

Fases en una reacción de PCR El producto de PCR se acumula en función del número de ciclos. Se distinguen las siguientes fases: La fase exponencial  hasta cerca del ciclo 30 esta bajo las condiciones estándar de reacción. La  fase plateau  resulta de cantidades limitantes de enzima y/o reducción actividad enzimática.

Causas de Efecto Plateau Agotamiento de los sustratos (dNTPs o primers). Estabilidad de los reactivos (dNTPs o enzima) particularmente a la tº de desnaturalización. Inhibición por los productos finales generados (pirofosfato, duplex de DNA). Competición de los reactivos por productos no específicos o dímeros de cebadores. Incompleta desnaturalización / separa-ción de hebras a altas concentraciones del producto.

CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD DISMINUIR: Mg++ [d NTP] LARGO DE LOS CICLOS NUMERO DE CICLOS CONCENTRACION DE PRIMER AUMENTAR: Tº DE ANNEALING

RESUMEN: MENOR TIEMPO Y MAYOR Tº DE ANNEALING: MAYOR ESPECIFICIDAD CICLOS EXTRAS: MENOR ESPECIFICIDAD PARA OBTENER MAS MASA DE AMPLIFICACION SE REALIZA REAMPLIFICACION CONTROL NEGATIVO: SIN ADN MUESTRA CON ADN QUE NO CONTIENE SECUENCIA TARGET SOLUCION DE EXTRACCION DE ADN

VARIANTES DE PCR PARA MEJORAR ESPECIFICIDAD HOT START PCR: EVITA PRODUCTOS INESPECIFICOS GENERADOS INICIALMENTE CUANDO AUMENTA LA Tº

EVALUACION