Estructura y propiedades de los canales de iones Jueves 16 de abril: ftp://einstein.ciencias.uchile.cl/ Cursos_2009 CursoTroncal Clase 1 er semestre
Canales de iones dependientes de potencial eléctrico. Artículos para el seminario del martes 20 de abril: Doyleetal1998Science_280_69.pdf JiangEtal2003Nature423_42.pdf JiangEtal2003Nature_423_33.pdf Los archivos pdf están en el disco compacto. Hay además un archivo ppt con las figuras.
Axón de jibia Electrodo que inyecta corriente Electrodos para medir el potencial Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón. V x (t)
Estímulo en de 25 microamperes en x = 0. Dura 0,5 milisegundos y empieza a t = 0 milisegundo. Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio ms
0.04 ms0.12 ms0.52 ms1.24 ms1.88 ms2.28 ms2.92 ms3.72 ms4.60 ms5.48 ms6.44 ms8.04 ms8.84 ms9.80 ms10.76 ms15.12 ms
Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp) V comando El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad. Voltage clamp VmVm 1x 10 5 x
Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp) El potencial de la membrana es igual al comando. El ampérmetro A mide la corriente que pasa por la membrana contenida en 1 cm lineal de axón. A Voltage clamp V comando VmVm 1x 10 5 x
Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol (London) 117: Latorre et al Biofísica y Fisiología Celular. Sevilla,1996 Voltage clamp de un axón de jibia
Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na. La corriente que queda es la llevada por los canales de potasio
La corriente de llevada por los canales de sodio es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.
IKIK I Na ILIL ICIC ImIm Con voltage clamp: VmVm
IKIK I Na ILIL ICIC I m =0 Sin voltage clamp: VmVm En reposo V m = V r y dV/dt = 0:
Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) Im, (mAcm -2 ) V Na VLVL VKVK
Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) Im, (mAcm -2 ) V Na VLVL VKVK
Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) Im, (mAcm -2 ) V Na VLVL VKVK
The Nerve Impulse. This is a brief Textbook that covers the basics of the initiation and propagation of the nerve impulse using equivalent circuits with reference to ionic conductances. Voltage dependent conductances are explained on the basis of single channel properties. The text contains links to the simulation programs. Para saber más sobre impulso nervioso consulte el libro de texto del Dr. Francisco Bezanilla :
Los canales responsables del potencial de acción en el axón gigante de jibia tienen dos atributos importantes. Selectividad. Conducen Na + o K + en forma excluyente. Excitabilidad. Capacidad de cambiar su capacidad de conducir iones en función del voltaje.
Estructura
Topología de los canales de Ca 2+, Na + y K + sugerida de sus perfiles de hidrofobicidad x4 x2
Los canales pueden formarse a partir de una sola molécula de proteína, pueden ser tetrámeros o dímeros
En los canales de K+ dependientes de potencial el segmento S4 y el poro (P) están muy conservados
Doyle et al 1998 Science 280:69-77 KCsA de Streptomyces lividans Tema de seminario martes 22
Doyle et al 1998 Science 280:69-77 KCsA de Streptomyces lividans
Doyle et al 1998 Science 280:69-77 KCsA de Streptomyces lividans
Doyle et al 1998 Science 280:69-77
Zhou et al 2001 Nature 414:43-48 KCsA de Streptomyces lividans. El filtro de selectividad a más resolución
Razones de flujos unidireccionales Armstrong 2003 PNAS 100:
Hodgkin y Huxley The potasium permeability of a giant nerve fibre. J. Physiol ( London) 128: Los iones difunden en fila india a lo largo del canal.
El ion + es atraído por la carga negativa. El ion + es atrapado por la carga negativa. La ocupación múltiple del poro permite un tránsito rápido de los iones
El ion + se acerca a un par con carga neta cero El ion + se aleja de un par con carga neta cero. La ocupación múltiple del poro permite un tránsito rápido de los iones
Morais-Cabral et al 2001 Nature 413:37-42 Ion K+ Molécula de H2O Optimización energética de la rapidez de por el filtro de selectividad del potasio.
Potenciales de flujo Corrientes de flujo Un canal en que el agua y los iones se mueven en fila india Pongo igual concentración de potasio a ambos lados del canal Pongo igual potencial eléctrico a ambos lados del canal Que flujo neto de K se espera? Agrego un no electrolito a un lado del la membrana con el canal Que flujo neto de K se espera? Esta es la corriente de flujo. A que potencial el flujo se hace cero? Este es el potencial de flujo.
Corriente de K a través de un canal de potasio en presencia de un gradiente osmótico. Las concentraciones de K a ambos lados de la membrana son iguales por lo que el potencial de Nernst para el K es 0 mV. El gradiente osmótico lleva el potencial de inversión de la corriente a 4 mV. El flujo de agua por los canales arrastra potasio. Hay entre 2 y 4 moléculas de agua en el canal. Su longitud es de 6 a 12 angstrom. Alcayaga et al 1989 Biophysical J. 55:
Doyle et al 1998 Science 280: Å 6 a 12 A Alcayaga et al 1989
Morais-Cabral et al 2001 Nature 413: aguas/canal Alcayaga et al 1989
Los canales responsables del potencial de acción en el axón gigante de jibia tienen dos atributos importantes. Selectividad. Conducen Na + o K + en forma excluyente. Excitabilidad. Capacidad de cambiar su capacidad de conducir iones en función del voltaje.
Movimiento en un medio viscoso Velocidad = movilidad · fuerza (m s -1 ) La “fuerza” que impulsa el movimiento de los iones es su gradiante de potencial químico. J mol -1 m -1 movilidad = velocidad por unidad de fuerza ( ms -1 N -1 mol) N mol -1 velocidad = movilidad · fuerza (m s -1 )
Esta caja es un elemento de volumen de un sistema más grande. En la caja hay moléculas que se están moviendo impulsadas por un gradiente de potencial químico. La velocidad de las moléculas es v ms -1 Todas las moléculas que están a una distancia v t atraviesan la pared de la izquierda en un tiempo t v vtvt A Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t + t. El número de moles del soluto presente en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v t. c
Todas las moléculas que están a una distancia v t atraviesan la pared de la izquierda en un tiempo t v vtvt A Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t + t. c A v t El número de moles presentes en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v t. c El número de moles que atraviesa cada unidad de área por unidad de tiempo se llama Flujo, J. mol m -2 s -1
v vtvt A Todas las moléculas que estaban en la caja a tiempo t han atravesado la pared al tiempo t + t. c A v t El número de moles presentes en la caja es igual a su concentración c multiplicada por el volumen de la caja. c A v t. c El número de moles que atraviesa cada unidad de área por unidad de tiempo se llama Flujo, J. mol m -2 s -1 J = c movilidad fuerza
Para estudiar la selectividad de los canales compararemos los flujos de los iones medidos al aplicar la misma fuerza a todos. Los factores que gobiernan la selectividad son entonces la concentración y la movilidad.
J = concentración movilidad fuerza Movilidades relativas a la del K en el agua En un poro acuoso las diferencias de movilidades entre Na y K son pequeñas Examinemos entonces las concentraciones
Suponiendo que el flujo es pequeño, se puede usar el coeficiente de partición, , para expresar la concentración en el borde de la membrana en función de la concentración en el seno de la solución. C (membrana) C (solución) ¿Cuál es la concentración dentro de una membrana? J = c sol movilidad fuerza
En el equilibrio ( J = 0 ) los potenciales químicos son iguales
Ver artículo de Armstrong en: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5: La posición de mínima energía para el ion es equidistante de los grupos C=O. La energía de interacción es igual para todos los iones
Estados de referencia: 1 mol por litro de ion en fase gaseosa Solución 1 molal de iones en agua Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y gaseosa. Robinson and Stokes “Electrolyte Solutions” Butterworths,London 1959.
Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y una membrana que no interactúe con los iones. Gran diferencia de coeficiente de partición entre fase acuosa y gaseosa. J = c sol movilidad fuerza Pregunta: ¿Cual será la selectividad de una membrana que interactúa por igual con todos los iones?
J = c sol movilidad fuerza Pregunta: ¿Cual será la selectividad de una membrana que interactúa por igual con todos los iones? Muy bien: la selectividad será Cs > Rb > K > Na > Li Agreguemos ahora un efecto de tamiz: discriminación por tamaño.
Por la energía de hidratación: la selectividad es Cs > Rb > K > Na > Li ¿Cuál será el ion preferido si se excluye el Cs y el Rb por tamaño?. ¿Cuál será el ion preferido si se excluye el Cs, Rb y K por tamaño?. El potasio El sodio
Los canales responsables del potencial de acción en el axón gigante de jibia tienen dos atributos importantes. Selectividad. Conducen Na o K en forma excluyente. Excitabilidad. Capacidad de cambiar capacidad de conducir iones en función del voltaje.
Los canales tienen una compuerta en la entrada intracelular. CH3 N CH2 CH3 CH2 CH3CH2CH3 Tetra Etil Amonio TEA El TEA bloquea los canales de K con una cinética muy rápida CH3 N CH2 CH3 (CH2)8 CH2CH3CH2CH3 C9 C9 también bloquea pero su cinética es lenta. + +
Armstrong 1971 JGP 58:413 Control
Armstrong 1971 JGP 58:413 +C9
Armstrong 1971 JGP 58:413 ++C9
Armstrong 1971 JGP 58: C9
Armstrong 1971 JGP 58:413
También en: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5: Armstrong 1971 JGP 59:413
En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5: Armstrong 1971 JGP 59:413
En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5: Armstrong 1971 JGP 59:413
Conclusiones 1971: El canal de K es un poro La compuerta está por dentro Hay un vestíbulo interno amplio capaz de alojar C9 Las paredes del vestíbulo son hidrófobas. Salto en el tiempo al siglo XXI
Doyle et al 1998 Science 280:69-77 El cristal de KcsA corresponde a un canal cerrado Bicapa
KcsA MthK Jiang et al 2002 Nature 417: El cristal de MthK corresponde a un canal abierto Methanobacterium thermoautotrophicum
Mecanismo de activación por ligandos intracelulares MthK, canal de potasio activado por calcio intracelular de Methanobacterium thermoautotrophicum. Jiang et al 2002 Nature 417:
KcsAMthK Apertura 4 Ǻ 26Ǻ La compuerta cerrada deja una abertura de 4 Ǻ de diámetro. Pero el K + tiene sólo 2 Ǻ de diámetro. ¿Por qué el K + no puede pasar?
Max Born Born: 11 Dec 1882 in Breslau, Germany (now Wroclaw, Poland) Died: 5 Jan 1970 in Göttingen, Germany Energía necesaria para cargar un ion en medios de diferente constante dieléctrica. Self energy. Energía de Born Ver LaEnergiadeBorn.ppt en einstein.ciencias.uchile.cl
Parsegian V. A ParsegianNature_221_844_1969 Ion en una membrana ion en un poro ion en un carrier
Parsegian V. A ParsegianNature_221_844_1969
Doyle et al 1998 Science 280:69-77 Dibujo esquemático del canal KcsA mostrando tres iones potasio en su interior
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de una bicapa de 40 Ǻ de espesor y = 2 Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la proteína puesta en la bicapa = 2 Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando el efecto de las cargas de la proteína Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando sólo el efecto de las hélices del poro. Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al canal de entrada cerrado Parsegian V. A ParsegianNature_221_844_1969ParsegianNature_221_844_1969
Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al canal de entrada abierto
Identificación de las cargas del sensor de potencial
Un Condensador eléctrico consiste en dos placas conductoras separadas por un aislante. Al cargar un condensador con una carga Q, se genera una diferencia de potencial eléctrico, V: Un condensador de una capacidad de 1 Farad adquiere una diferencia de potencial de 1 Volt al cargarlo con 1 Coulomb. La intensidad de una corriente eléctrica, I, se mide en Amperes. Una corriente de 1 Amper transporta 1 Coulomb por segundo. Un condensador de una capacidad de 1 Farad se demora un segundo al cargarlo con una corriente de 1 Amper.
t = 0s, V = 0 Volts 1A t = 1s, V = 1 Volt Vacío entre las placas
t = 0s, V = 0 Volts 1A t = 10s, V = 1 Volt Un diléctrico entre las placas
t = 0s, V = 0 Volts A t = 10s, V = 1 Volt Un diléctrico entre las placas
V = 1.0 Volt Las cargas del dieléctrico se mueven en el campo eléctrico produciendo una corriente de desplazamiento: Las corriente de desplazamiento representa movimiento de cargas positivas desde el lado positivo hacia el lado negativo. Esta corriente transportó 9 Coulombs en 10 segundos. Representa la polarización del dieléctrico.
-40 mV -100 mV +40 mV Animación sensores.exe
Oocitos sin Shaker Oocitos con Shaker Aggarwal y MacKinnon Neuron 16: Canal de potasio Shaker de Drosophila
Oocito de Xenopus expresado el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX Sin ShakerCon Shaker Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
Oocito de Xenopus expresado el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX Sin ShakerCon Shaker Cerrados Abiertos Transición Carga desplazada Q = 40 nC, pero ¿de cuántos canales? Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
El número de canales se determina con AGTX radiactiva de actividad específica conocida. Resulta 13.6 cargas por canal Aggarwal y MacKinnon Neuron 16: Número de cargas elementales Número de canales
>shaker MAAVAGLYGL GEDRQHRKKQ QQQQQHQKEQ LEQKEEQKKI AERKLQLREQ QLQRNSLDGY GSLPKLSSQD EEGGAGHGFG GGPQHFEPIP HDHDFCERVV INVSGLRFET QLRTLNQFPD TLLGDPARRL RYFDPLRNEY FFDRSRPSFD AILYYYQSGG RLRRPVNVPL DVFSEEIKFY ELGDQAINKF REDEGFIKEE ERPLPDNEKQ RKVWLLFEYP ESSQAARVVA IISVFVILLS IVIFCLETLP EFKHYKVFNT TTNGTKIEED EVPDITDPFF LIETLCIIWF TFELTVRFLA CPNKLNFCRD VMNVIDIIAI IPYFITLATV VAEEEDTLNL PKAPVSPQDK SSNQAMSLAI LRVIRLVRVF RIFKLSRHSK GLQILGRTLK ASMRELGLLI FFLFIGVVLF SSAVYFAEAG SENSFFKSIP DAFWWAVVTM TTVGYGDMTP VGVWGKIVGS LCAIAGVLTI ALPVPVIVSN FNYFYHRETD QEEMQSQNFN HVTSCPYLPG TLGQHMKKSS LSESSSDMMD LDDGVESTPG LTETHPGRSA VAPFLGAQQQ QQQQPVASSL SMSIDKQLQH PLQHVTQTQL YQQQQQQQQQ QQNGFKQQQQ QTQQQLQQQQ SHTINASAAA ATSGSGSSGL TMRHNNALAV SIETDV Estructura primaria del producto de expresión de un gen que le falta al mutante Shaker de Drosophila. Hay 7 cargas positivas en el posible sensor de potencial
= 3.9 cargas para R1 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
= 3.9 cargas para R = 4.8 cargas para R2 suman 8.1 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
= 3.9 cargas para R = 4.8 cargas para R2 suman = 3.6 cargas para R3 suman 11.7 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
= 3.9 cargas para R = 4.8 cargas para R2 suman = 3.6 cargas para R3 suman = 3.8 cargas para R14 suman 14.5 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
= 3.9 cargas para R = 4.8 cargas para R2 suman = 3.6 cargas para R3 suman = 3.8 cargas para R4 suman = 2.1 cargas para K5 suman 15.6 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
= 3.9 cargas para R = 4.8 cargas para R2 suman = 3.6 cargas para R3 suman = 3.8 cargas para R4 suman = 2.1 cargas para K5 suman = 0.1 cargas para K7 suman 15.6 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:
Experimentos de reactivos de grupos SH. MTSET CH 3 -S0 2 -S-CH 2 -CH 2 -N + -(CH 3 ) 3 Hacer una mutación puntual, por ejemplo R326C Comparar la rapidez de la reacción de cisteína-MTSET para el canal abierto y el canal cerrado, poniendo MTSET ya sea por el interior o por el exterior.
R1 R362 R2 R365 R3 R368 R4 R371 K5 K374 Esquema resumen de la accesibilidad de los residuos del segmento S4 Larsson et al 1996 Neuron 16:
Modelo 1966 del funcionamiento del sensor de potencial eléctrico Jiang et al 2003 Nature 423:33-41 El desplazamiento vertical es de 16 Ångström
Estructura cristalina del canal de potasio activado por potencial eléctrico KvaP de Aeropyrum pernix.Vista desde el lado intracelular Jiang et al 2003 Nature 423:33-41 Fragmento de anticuerpo S4
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
La estructura cristalina difiere de la esperada. Los segmentos de hélices alfa no están perpendiculares al plano de la membrana. El segmento S4 está fuera de la membrana. El segmento S3 está dividido en dos segmentos S3a y S3b. El segmento S6 está quebrado: el canal está abierto Esta estructura está distorsionada por la inmovilización del S3b-S4 por el Fab.
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41 Estructura cristalina del sensor de potencial aislado de KvaP Cristal completo Composición de los dos cristales
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
Para saber como sigue la historia del modelo de sensor de potencial en canales de eucariontes vea: Long et al Science : Long et al Science : Long et al Science :
Long et al Science : Canal de potasio de mamífero Kv1.2
Long et al Science : Quimera del Canal Kv1.2 con el sensor de potencial de Kv2.1 cristalizado con fosfolípidos y detergente
Long et al Science :