Segunda parte Martes 17 de abril: 14.30-17.30 ftp://einstein.ciencias.uchile.cl/ CursoTroncal2007.

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1 Segunda parte Martes 17 de abril: 14.30-17.30 ftp://einstein.ciencias.uchile.cl/ CursoTroncal2007

2 Los canales responsables del potencial de acción en el axón gigante de jibia tienen dos atributos importantes. Selectividad. Conducen Na o K en forma excluyente. Excitabilidad. Capacidad de cambiar capacidad de conducir iones en función del voltaje.

3 Los canales tienen una compuerta en la entrada intracelular. CH3 N CH2 CH3 CH2 CH3CH2CH3 Tetra Etil Amonio TEA El TEA bloquea los canales de K con una cinética muy rápida CH3 N CH2 CH3 (CH2)8 CH2CH3CH2CH3 C9 C9 también bloquea pero su cinética es lenta. + + Armstrong 1971 JGP 58:413

4 Control

5 Armstrong 1971 JGP 58:413 +C9

6 Armstrong 1971 JGP 58:413 ++C9

7 Armstrong 1971 JGP 58:413 +++C9

8 Armstrong 1971 JGP 58:413

9 En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119 Armstrong 1971 JGP 59:413

10 En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119 Armstrong 1971 JGP 59:413

11 En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119 Armstrong 1971 JGP 59:413

12 Conclusiones 1971: El canal de K es un poro La compuerta está por dentro Hay un vestíbulo interno amplio capaz de alojar C9 Las paredes del vestíbulo son hidrófobas. Salto en el tiempo al siglo XXI

13 Doyle et al 1998 Science 280:69-77 El cristal de KcsA corresponde a un canal cerrado Bicapa

14 KcsA MthK Jiang et al 2002 Nature 417:515-522 El cristal de MthK corresponde a un canal abierto

15 Mecanismo de activación por ligandos intracelulares. Jiang et al 2002 Nature 417:523-526

16 417523-aS2.mov 417515-aS2.mov Jiang et al 2002 Nature 417:523-526 417515a-s2.mov 417523a-s2.mov

17 KcsAMthK Apertura 4 Ǻ 26Ǻ La compuerta cerrada deja una abertura de 4 Ǻ de diámetro. Pero el K+ tiene sólo 2 Ǻ de diámetro. ¿Por qué el K + no puede pasar?

18 Electrostática : Una carga eléctrica, q, genera un campo eléctrico a su alrededor. Este campo se manifiesta por el potencial eléctrico en la vecindad de la carga. El potencial eléctrico,  de un punto en el espacio se define como el trabajo (joule) necesario para traer una carga unitaria (1 coulomb) desde el infinito a ese punto del espacio. Se mide en Volts (joules/coulomb) El potencial eléctrico depende de distancia entre el punto y la carga que crea el campo. El gradiente de potencial eléctrico se llama intensidad de campo E. Se mide en volt/metro es una magnitud vectorial y su magnitud y tiene unidades de newton coulomb -1. E El flujo eléctrico  que emana de una superficie cerrada es la integral de la intensidad de campo eléctrico sobre el toda el área de la superficie cerrada. dA es un elemento,minfinitesimal de área, normal a E

19 La ley de gauss: La ley de Gauss dice que el flujo proporcional a la carga q encerrada en la superficie cerrada. dA es un elemento,infinitesimal de área, normal a E El flujo eléctrico  que emana de una superficie cerrada es la integral del campo eléctrico potencial eléctrico sobre el toda el área de la superficie cerrada. El factor de proporcionalidad es 1/  y   es la permitividad eléctrica. Para una esfera de radio r con una carga puntual Q al medio, la integral es fácil porque la intensidad de campo E es igual en toda la superficie.

20 Ésta es el la fuerza que siente una carga unitaria puesta a una distancia r de la carga q. Ahora podemos calcular el trabajo necesario, para traer una carga unitaria desde el infinito a un distancia r de la carga q. Potencial eléctrico en la superficie de una esfera cargada.

21 El trabajo para aumentar la carga de la esfera en un dq es  dq. La energía necesaria para cargar la esfera es la integral desde carga 0 hasta carga = q. La energía necesaria para cargar la esfera es siempre positiva es la auto energía, self energy, o energía de Born. Max Born Born: 11 Dec 1882 in Breslau, Germany (now Wroclaw, Poland) Died: 5 Jan 1970 in Göttingen, Germany

22 Si un átomo tiene una carga z i, y la carga del electrón es e o la energía para un mol es su auto-energía molar: Calcular la auto energía para un átomo con z = 1 y un radio de 1 Å.

23 Recordar: Esto es en el vacío. En un medio material la auto energía es menor: cambia por un factor 1/  en que  es la constante dieléctrica del medio. Para el agua  w = 80 y para la bicapa de lípidos  b = 2.

24 Doyle et al 1998 Science 280:69-77

25 6.3 kcal/mol Energía libre de tansferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102

26 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua un medio de constante dieléctrica 2

27 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de una bicapa de 40 Ǻ de espesor y  = 2 Parsegian V. A. 1969 Nature 221:884.

28 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la proteína puesta en la bicapa  = 2 Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102 Parsegian V. A. 1969 Nature 221:884.

29 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102 Parsegian V. A. 1969 Nature 221:884.

30 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102

31 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando el efecto de las cargas de la proteína Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102

32 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando sólo el efecto de las hélices del poro. Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102

33 Estructura del canal KcsA cerrado  nm Estructura del canal MthK abierto Sólo tres subunidades dibujadas Flexión de 30 0 de la hélice interna 0.4 nm 1.0 nm Jiang et al 2002 Nature 417:523-526

34 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al canal de entrada cerrado

35

36 Energía libre de transferencia del ion K + desde el agua al canal de entrada abierto

37 Identificación de las cargas del sensor de potencial

38 Un Condensador eléctrico consiste en dos placas conductoras separadas por un aislante. Al cargar un condensador con una carga Q, se genera una diferencia de potencial eléctrico, V: Un condensador de una capacidad de 1 Farad adquiere una diferencia de potencial de 1 Volt al cargarlo con 1 Coulomb. La intensidad de una corriente eléctrica, I, se mide en Amperes. Una corriente de 1 Amper transporta 1 Coulomb por segundo. Un condensador de una capacidad de 1 Farad se demora un segundo al cargarlo con una corriente de 1 Amper.

39 t = 0s, V = 0 Volts 1A t = 1s, V = 1 Volt Vacío entre las placas

40 t = 0s, V = 0 Volts 1A t = 10s, V = 1 Volt Un diléctrico entre las placas

41 t = 0s, V = 0 Volts + + + +- - - - 1A t = 10s, V = 1 Volt + + + + - - - - Un diléctrico entre las placas

42 V = 1.0 Volt + + + + + + + + - - - - - - - - Las cargas del dieléctrico se mueven en el campo eléctrico produciendo una corriente de desplazamiento: Las corriente de desplazamiento representa movimiento de cargas positivas desde el lado positivo hacia el lado negativo. Esta corriente transportó 9 Coulombs en 10 segundos. Representa la polarización del dieléctrico.

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44 Oocitos sin Shaker Oocitos con Shaker Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177 Oocito de Xenopus expresando el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX

45 Sensores Animación sensores.exe sensores.exe

46 -40 mV -100 mV +40 mV

47 Oocito de Xenopus expresando el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX Sin ShakerCon Shaker Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

48 Oocito de Xenopus expresando el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX Sin ShakerCon Shaker Cerrados Abiertos Transición Carga desplazada Q = 40 nC, pero ¿de cuántos canales? Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

49 El número de canales se determina con AGTX radiactiva de actividad específica conocida. Resulta 13.6 cargas por canal Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177 Número de cargas elementales Número de canales

50 >shaker 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1 MAAVAGLYGL GEDRQHRKKQ QQQQQHQKEQ LEQKEEQKKI AERKLQLREQ 50 51 QLQRNSLDGY GSLPKLSSQD EEGGAGHGFG GGPQHFEPIP HDHDFCERVV 100 101 INVSGLRFET QLRTLNQFPD TLLGDPARRL RYFDPLRNEY FFDRSRPSFD 150 151 AILYYYQSGG RLRRPVNVPL DVFSEEIKFY ELGDQAINKF REDEGFIKEE 200 201 ERPLPDNEKQ RKVWLLFEYP ESSQAARVVA IISVFVILLS IVIFCLETLP 250 251 EFKHYKVFNT TTNGTKIEED EVPDITDPFF LIETLCIIWF TFELTVRFLA 300 301 CPNKLNFCRD VMNVIDIIAI IPYFITLATV VAEEEDTLNL PKAPVSPQDK 350 351 SSNQAMSLAI LRVIRLVRVF RIFKLSRHSK GLQILGRTLK ASMRELGLLI 400 401 FFLFIGVVLF SSAVYFAEAG SENSFFKSIP DAFWWAVVTM TTVGYGDMTP 450 451 VGVWGKIVGS LCAIAGVLTI ALPVPVIVSN FNYFYHRETD QEEMQSQNFN 500 501 HVTSCPYLPG TLGQHMKKSS LSESSSDMMD LDDGVESTPG LTETHPGRSA 550 551 VAPFLGAQQQ QQQQPVASSL SMSIDKQLQH PLQHVTQTQL YQQQQQQQQQ 600 601 QQNGFKQQQQ QTQQQLQQQQ SHTINASAAA ATSGSGSSGL TMRHNNALAV 650 651 SIETDV Estructura primaria del producto de expresión de un gen que le falta al mutante Shaker de Drosophila. Hay 7 cargas positivas en el posible sensor de potencial

51 13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

52 13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1 13.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

53 13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1 13.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1 13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

54 13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1 13.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1 13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7 13.6 -9.8 = 3.8 cargas para R14 suman 14.5 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

55 13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1 13.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1 13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7 13.6 -9.8 = 3.8 cargas para R4 suman 14.5 13.6 -11.5 = 2.1 cargas para K5 suman 15.6 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

56 13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1 13.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1 13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7 13.6 -9.8 = 3.8 cargas para R4 suman 14.5 13.6 -11.5 = 2.1 cargas para K5 suman 15.6 13.6 -13.5 = 0.1 cargas para K7 suman 15.6 Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177

57 Experimentos de reactivos de grupos SH. MTSET CH 3 -S0 2 -S-CH 2 -CH 2 -N + -(CH 3 ) 3 Hacer una mutación puntual, por ejemplo R326C Comparar la rapidez de la reacción de cisteína-MTSET para el canal abierto y el canal cerrado, poniendo MTSET ya sea por el interior o por el exterior.

58 R1  R362 R2  R365 R3  R368 R4  R371 K5  K374 Esquema resumen de la accesibilidad de los residuos del segmento S4 Larsson et al 1996 Neuron 16:387-397

59 Modelo 1966 del funcionamiento del sensor de potencial eléctrico Jiang et al 2003 Nature 423:33-41 El desplazamiento vertical es de 16 Ångström

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61 Gonzalez et al 2000 J. Gen. Physiol. 115:193-207

62 Estructura cristalina del canal de potasio activado por potencial eléctrico KvaP Vista desde el lado intracelular Jiang et al 2003 Nature 423:33-41 Fragmento de anticuerpo S4

63 Jiang et al 2003 Nature 423:33-41

64 La estructura cristalina difiere de la esperada. Los segmentos de hélices alfa no están perpendiculares al plano de la membrana. El segmento S4 está fuera de la membrana. El segmento S3 está dividido en dos segmentos S3a y S3b. El segmento S6 está quebrado: el canal está abierto Esta estructura está distorsionada por la inmovilización del S3b-S4 por el Fab.

65 Jiang et al 2003 Nature 423:33-41 Estructura cristalina del sensor de potencial aislado de KvaP Cristal completo Composición de los dos cristales

66 Jiang et al 2003 Nature 423:42-48 Modelo de remo (paddle) del sensor de potencial CerradoAbierto

67 Jiang et al 2003 Nature 423:33-41

68 Gonzalez et al Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005 102: 5020-5025.

69 Los residuos del segmento S3b son accesibles en el estado de reposo o activo del sensor de potencial.

70 Francisco Bezanilla IEEE TRANSACTIONS ON NANOBIOSCIENCE, VOL. 4, NO. 1, MARCH 2005 34-48

71 Sensores Animación opcl.exe opcl.exe