Ejemplo de un “insulator” con efecto bloqueador de enhancer Ejemplo de un “insulator” con efecto barrera y bloqueador de enhancer Ejemplo de “insulator” con efecto de barrera

Ensayo para medir la actividad bloqueante de enhancer

Construcción para medir efecto barrera

ENCODE: encyclopedia of DNA elements Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF binding sites in the human genome Cell. 2007 March 23; 128(6): 1231 ENCODE: encyclopedia of DNA elements Fibroblastos humanos- ChIP-chip contra CTCF Se encontraron 14000 sitios de binding CTCF. Comparación de los sitios de binding a CTCF en dos tipos de células Distancias de los sitios CTCF a los extremos 5’ de genes

Objetivo: estudiar la regulación epigenética del locus de las apolipoproteínas ApoA1, ApoA4 y ApoA5 constituyentes HDL- ApoA3, constituyende VLDL Antecedentes: ● Experimentos de ChIP-chip encontraron unos 14000 sitios de unión a CTCF en el genoma humano . ● Muchos sitios CTCF se corresponden con el enriquecimiento en complejos de cohesina (RAD21), que median la cohesion de cromátidas hermanas en mitosis ● No se estudió si hay correlacion entre cohesina y CTCF en la actividad de los insulators

Distribucion de sitios enriquecidos en CTCF/Rad21 en el locus Apo ChIP-chip en líneas celulares humanas Verificación por ChIP comprobación in vitro por gel shift Conclusión: hay tres sitios de unión a CTCF : AC1, AC2, AC3 (que unen tambien Rad21, y un sitio AR1 que si bien tiene secuencia de cierto renocimiento a CTCF no lo une, pero si une Rad21

Comprobación de la actividad bloqueante de enhancers de los AC1 Comprobación de la actividad bloqueante de enhancers de los AC1. AC2, AC3 y AR1 Conclusión: los AC son aislantes funcionales Bloquean un 40-60% la acción del enhancer C3 en una respuesta independiente de la orientacion Su efecto es mediado por la unión de CTCF Se descarta que tengan efecto de silenciador AR1 tiene un efecto bloqueante moderado

Efecto de HNFa sobre el enhancer y promotor de ApoA4 HNFa: principal regulador transcripcional hígado produce activación a traves del promotor y del C3E ChIP demuestra que está unido tanto al promotor como al C3E La expresión de HNFa en HeLa promueve la expresión de los genes APOA1/C3/A4/A5 y no la de los tres genes vecinos Por ChIP se demuestra que se une a los 4 promotores y al enhancer Por lo tanto los elementos AC2 y AC3 actúan como aislantes

CTCF y cohesinas están involucrados en el control transcripcional de la región APO Células Hep3B: tratadas o no con siRNA contra CTCF o Rad21. Medición de niveles de mRNA de cada gen por RT-PCR Conclusiones: la deleción de CTCF/Rad21 afecta diferencialmente los genes dentro de AC2 y AR1 y los que estan fuera de esa región

CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma Metodología: 3C, framentos BglII; frecuencia de ligación con el enhancer APOC3

CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma Conclusión: los aislantes dependientes de CTCF y cohesinas mantienen la conformación global del locus APO

Localización espacial del locus 3C más resolutiva para resolver entre interacciones insulator-promotor; promotor-promotor, insulator-insulator Se usa otra enzima de restriccion MflI

Modelos para la actividad bloqueante de enhancers de los “insulators”

Un balance de actividades determina el limite de propagación de la cromatina

Mecanismo simplificado al mecanismo de propagación y de automantenimiento de la heterocromatina en S.pombe

Distribución de Swi6, H3-K9 met o H3-K4 met en el locus Mat al delecionar los elementos aislantes