Vectores Plásmidos o Vectores Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Vectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. Vectores de expresión, poseen toda la información necesaria para llegar expresar una secuencia aminoacídica.

Vectores de clonado PLASMIDOS Características: moléculas de DNA que se encuentran en y se replican en forma independiente del cromosoma bacterias Características: Son pequeños (miles de pares de bases) Son circulares Tienen un único origen de replicación Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción Gran numero de copias Marcadores que permitan su reconocimiento

Características generales de un vectores de clonado: Sitios de restricción únicos mcs Marcadores genéticos (permiten selección de transformantes) pBR322 4361 bp Orígen de replicación Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)

Vectores de expresión eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador. Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa. Tata Box Promotor Elementos promotores Constitutivos: SV40, RSV, CMV, hEF-1a Inducibles: Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina Olac inducible por IPTG Metalotioneína inducible por metales pesados GAL4-E1b inducible por mifepristona

Vectores de expresión eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador. Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa. Terminador: Sitio de terminación de la transcripción. Sitio de unión a ribosomas: se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traducción (Secuencias Kozak y codón ATG). Sitio de clonado múltiple (MCS): Región del vector que posee varias secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de restricción. Factor de selección: Codifica el/los marcador/es de selección que permita diferenciar células transformadas. Otras características: secuencias codificantes para fusion-tag, His-tag, péptido señal de localización periplasmatica, etc. Segmentos de DNA para recombinación homóloga (para transfecciones estables).

Vectores de expresión eucariotas

Resumiendo..... k Obtención de grandes cantidades del plásmido para su posterior transfección a células eucariotas.

Clonado de PTP1B en el vector de expresión eucariota pGFP-N1

Transfección de células eucariotas

Se usa el término Transfección para denominar la entrada de DNA foráneo a las células eucariotas mediante métodos químicos o físicos. Se denomina Infección a la introducción de DNA foráneo dentro de las células eucariotas mediante la utilización de moleculas virales.

Objetivos de la transfección - Expresión de proteínas para su purificacón. - Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular. - Estudio de promotores y elementos regulatorios. - Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. Estudio de interacción de proteínas. - Estudio de localizacion subcelular de proteínas. - Terapia génica.

Métodos químicos: DEAE-Dextrano Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos. Métodos químicos: DEAE-Dextrano Coprecipitados de Fosfato de calcio Lípidos cationicos (Liposomas) Métodos físicos: Biobalística Microinyección Electroporación

Métodos químicos

Métodos Físicos Electroporación Microinyección Biobalistica

Métodos Físicos Biobalistica

Resumen Liposomas alta eficiencia, no-tóxico, estables Fosfato de calcio simple, baja eficiencia, no para estable DEAE-dextrano simple, alta efiencia, no para estable,toxico para algunas líneas celulares Electroporación alta eficiencia, altos niveles de muerte Microinyección laborioso, alta eficiencia Biobalística baja eficiencia, muy costosa, se han logrado buenos resultdos solo para células vegetales

Transfección estable y transiente Por integración Por recombinación homóloga Requiere de un marcador de selección en el vector Util para estudios que impliquen inducción de la expresión Transfección estable

Transfección estable y transiente Transfección transiente (48 a 72 horas) Análisis rápido Múltiples propósitos Análisis de secuencias regulatoria

Consideraciones para transfección con lípidos cationicos Tansfección en presencia de suero Antibióticos en el medio de cultivo Densidad celular Elección del promotor Cantidad de DNA

Infección: proceso mediado por una molécula viral donde la células target son infectadas con un virus que lleva clonado la secuencia de interés en su genoma. Ejemplos: Vaccinia Semmliky Baculovirus