IMPACTO DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA DINÁMICA DE FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO Beatriz Rodríguez Alonso, Carmen López Fernández, Rocío Núñez Calonge, Pedro Caballero, Manuel Martínez Moya, Carolina Alonso, Beatriz Martín, Agustín García Peiró y Jaime Gosálvez.

Introducción Infertilidad: Factor masculino Estudio básico: Seminograma Un 15% de los casos de infertilidad presentan un seminograma normal. En estos casos se debe analizar la muestra en mayor profundidad: fragmentación del ADN espermático.   Para realizar un correcto diagnóstico en la infertilidad es fundamental estudiar a ambos miembros de la pareja y en lo que respecta al factor masculino el seminograma es una prueba básica. En muchas ocasiones solo con este estudio tenemos un primer diagnóstico, pero en un 15% de los casos de infertilidad, los parámetros medidos están dentro de la normalidad. En estos casos se debe analizar la muestra en mayor profundidad y es cuando recurrimos a los estudios complementarios como el de la fragmentación del ADN espermático.

Introducción Fragmentación del ADN espermático Roturas en el ADN (de cadena sencilla y de cadena doble) Causas de diferente etiología, siendo el estrés oxidativo una de ellas.   La fragmentación del ADN es precisamente eso: roturas en el ADN que afectan tanto a una de las cadenas como a las dos (siendo roturas de cadena doble). Los defectos en el material genético en el espermatozoide se deben a muchas causas de diferente etiología, siendo el estrés oxidativo una de ellas.

Introducción Estrés oxidativo Radicales libres de oxígeno (ROS: Reactive Oxygen Species). Ceden su electrón desapareado oxidando lípidos de membrana, aminoácidos de proteínas y carbohidratos como los del ADN. Anión superóxido El estrés oxidativo tiene lugar cuando la producción de ROS sobrepasa la capacidad antioxidante.   El Estrés oxidativo está provocado por radicales libres que son moléculas que contienen electrones desapareados. El modo en que ejercen el daño es a través de reacciones químicas en las que ceden su electrón desapareado oxidando distintas estructuras celulares. En este trabajo nos hemos centrado en la detección del anión superóxido, que es la forma primaria de ROS, y se forma a partir de la captación de un electrón por una molécula de oxígeno. Una vez dicho esto es importante matizar que el estrés oxidativo realmente tiene lugar cuando la producción de radicales sobrepasa la capacidad antioxidante de los mecanismos de defensa, lo que lleva al daño celular.

Introducción Leucocitos Espermatozoides Estrés oxidativo en el semen Origen: Leucocitos y espermatozoides. Causan infertilidad principalmente por dos mecanismos: - Dañando las membranas de los espermatozoides. - Dañando al ADN del espermatozoide. Leucocitos Espermatozoides Centrándonos en lo que respecta al semen hay principalmente dos fuentes de producción de radicales libres:   - (por un lado los) Leucocitos: como los neutrófilos son el tipo predominante en las muestras de semen y su mecanismo principal para destruir patógenos es producir ROS, lo que explica su capacidad para provocar estrés oxidativo (y por otra parte están los propios) Espermatozoides: En el caso de los espermatozoides la capacidad de producir ROS esta inversamente correlacionada con su estado de maduración. Los radicales libres son capaces de causar infertilidad principalmente por dos mecanismos: - Dañando a las membranas. - Dañan directamente al ADN del espermatozoide

Objetivo Caracterizar el exceso de estrés oxidativo relacionado con la presencia del anión superóxido Incidencia en la fragmentación del ADN espermático durante un periodo de 24 horas.   Objetivo Dado que el estrés oxidativo parece tener un efecto negativo directo sobre diferentes estructuras del espermatozoide y sobre el ADN, el objetivo del presente estudio es: …

Material y métodos N= 78 muestras obtenidas en 3 clínicas diferentes. Al tratarse de un estudio prospectivo no se establecieron criterios de selección sobre el tipo de paciente. De cada muestra calculamos: Nivel de estrés oxidativo (N1, N2, N3 o N4) Índice de fragmentación en las horas t0, t2, t6 y t24 (dinámica de fragmentación) Velocidad de fragmentación Para realizar el estudio contamos con 78 muestras y de cada una de ellas calculamos el nivel de estrés oxidativo (hay cuatro niveles distintos), el índice de fragmentación en cuatro momentos distintos para evaluar la fragmentación como un proceso dinámico y por último calculamos la velocidad de fragmentación a partir de la variación del índice de fragmentación a lo largo de las 24 horas que está la muestra incubando.

Índice de fragmentación = % fragmentados + % degradados Material y métodos Análisis de la fragmentación de ADN Técnica SCD Test (Sperm Chromatin Dispersion test): - Tratamiento ácido inicial que desnaturaliza el ADN. - Desproteinización controlada (retira la mayor parte de las proteínas nucleares) Índice de fragmentación = % fragmentados + % degradados En lo que respecta al análisis de la fragmentación del ADN utilizamos el SCD Test que todos conocemos. Este es el aspecto que tendrían los espermatozoides una vez procesados y teñidos. Si tienen halo se consideran espermatozoides normales y si no lo tienen fragmentados. El último tipo se considera degradado, y para calcular el índice de fragmentación de suma el procentaje de fragmentados y de degradados.

Material y métodos Dinámica de fragmentación Simulación in Vitro de las condiciones naturales en las que tendría lugar la fecundación (a 37ºC) para estudiar la variación del índice de fragmentación del ADN espermático a lo largo de 24 horas. T2 (SCD) T6 (SCD) T24 (SCD) Estufa 37º T0 (SCD) Como hemos explicado en este estudio no queremos solo centrarnos en el índice de fragmentación basal, que sería el t0 tras la eyaculación, sino en como evoluciona la fragmentación a lo largo de 24 horas. Para eso una vez recogida la muestra se toma una primera alícuota y se analiza el IF a las cero horas. El resto de la muestra se incuba en una estufa a 37 grados y se toman alícuotas a las 2, 6 y 24 horas. De esta forma conocemos el valor de la fragmentación en distintos momentos y podemos también calcular la velocidad a la que varía. GRÁFICA DINÁMICA A la hora de realizar nuestra dinámica de fragmentación nos hemos guiado por las pautas de este trabajo dado que consideramos esos puntos como críticos

Material y métodos Análisis del estrés oxidativo Test del estrés oxidativo NBT-test: El Nitro Blue Tetrazolio (NBT) reacciona con el anión superoxido formando diformazán. Para cartacterizar el exceso de estrés oxidativo utilizamos el NBT test, que básicamente consiste en la reacción del nitro blue tetrazolio con al anión superóxido que da lugar al diformazán. Este compuesto resultante de la reacción tiene color azul, por lo que la muestra tendrá más o menos intensidad de color dependiendo de si el plasma seminal tenía más o menos anión superóxido. Comparando el color final de la muestra con esta escala clasificamos a cada muestra en uno de los cuatro niveles. El primero sería el que tiene menos concentración del anión y el último, el N4, el que más.

Resultados Tiempo (horas) Media IF No voy a poner la tabla con todos los valores porque creo que es más claro explicar los resultados ayudándome de estas tres gráficas. En la gráfica de la izquierda analizamos el indíce de fragmentación medio de todas las muestras a lo largo de las 24 horas de incubación. Como era de esperar lo que se ve es que a lo largo del tiempo la tendencia de la fragmentación es aumentar. El índice de fragmentación aumenta a lo largo de las 24 horas.

Resultados En la gráfica de la derecha vemos también el valor de la fragmentación a lo largo de las 24 horas pero en este caso lo hemos estudiado por cada grupo de estrés oxidativo de los 4 posibles que hemos visto en el NBT test. Si nos centramos ahora en esta gráfica la primera cosa que vimos que nos llamó la atención es que no se correlaciona el nivel de estrés oxidativo con el IF basal. El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido no se correlaciona con el índice de fragmentación basal.

Resultados La línea morada representa a las muestras de mayor concentración del anión superóxido y como vemos tiene el nivel de fragmentación basal más bajo de todos los grupos. El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido no se correlaciona con el índice de fragmentación basal.

Resultados Si lo comparamos con la línea azul que es el de nivel 1 de estrés oxitativo vemos que tiene un mayor índice de fragmentación en to, por eso, como decía antes, el nivel de estrés oxidativo del anión superóxido no se correlaciona con el índice de fragmentación basal. El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido no se correlaciona con el índice de fragmentación basal.

Resultados Velocidad fragmentación Estrés oxidativo El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido se correlaciona con la velocidad de fragmentación. (Correlación de Pearson de 0,24; Sig. Bilateral = 0,035). En esta gráfica hemos representado en la vertical la velocidad de fragmentación, que es el valor de la pendiente de la recta de regresión calculada a partir de los cuatro datos del índice de fragmentación de la dinámica, con respecto al nivel de estrés oxidativo en la horizontal. En lo que respecta a las distintas velocidades de los distintos niveles no se diferencian significativamente entre ellas, sin embargo sí hay una correlación significativa entre la velocidad y el nivel de estrés oxidativo. Esto quiere decir que cuanto mayor es el nivel de estrés oxidativo ejercido por el anión superóxido mayor es la velocidad a la que el ADN espermático se fragmenta. Si trasladamos esta información al ámbito clínico vemos que el el NBT-t nos da información del comportamiento de la muestra seminal en lo referente a la velocidad de fragmentación. Esto lo que significa es que en aquellas muestras donde existe un estrés oxidativo elevado se recomendaría una mayor rapidez en el manejo de esas muestras, para evitar en la medida de lo posible una sobreexposición a este daño. Por otra parte y como opción de trabajo futuro, hay que tener en cuenta que el exceso de estrés oxidativo no se circunscribe a los singletes de oxigeno libres que existen en el plasma seminal.

Conclusiones No hemos encontrado una correlación significativa entre el nivel de estrés oxidativo del anión superóxido y el índice de fragmentación del ADN espermático basal. El NBT-t clasifica a las muestras en grupos que varían su fragmentación a una velocidad mayor según aumenta el nivel de estrés oxidativo. No hemos encontrado una correlación significativa entre el nivel de estrés oxidativo del anión superóxido y el índice de fragmentación del ADN espermático basal. No parece que una mayor concentración de este ión en el eyaculado implique un porcentaje mayor del índice de fragmentación cuando se analiza en t0 horas (tras la eyaculación). El NBT-t clasifica a las muestras en grupos que varían su fragmentación a una velocidad mayor según aumenta el nivel de estrés oxidativo. De esta forma, existe correlación positiva entre la velocidad de daño y el estrés oxidativo cuantificado con el NBT-t.

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