PCR en Tiempo Real

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Repasemos… Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Técnica que permite copiar o replicar millones de veces pequeñas cantidades de ADN in vitro. MUY SENSIBLE Y MUY ESPECÍFICA

PCR PCR ADN polimerasa termoestable Molécula de ADN (molde) Cebador sentido Cebador Antisentido Cofactor Mg2+ dNTPs (A;G;T;C)

PCR Tres pasos básicos Desnaturalización Apareamiento Elongación Primers complementarios Apareamiento Elongación

PCR

PCR Verificación del producto de PCR en gel de agarosa Marcador de tamaño molecular Productos de PCR

¿La PCR puede ser cuantitativa?

PCR en Tiempo Real En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.

No requieren amplificación Northern Blot PCR tradicional PCR en tiempo real Gold Standard No requieren amplificación Grandes cantidades de ARN Radioactividad Semi-cuantitativa Requiere amplificación Pequeñas cantidades de ARN Sensible Cuantitativa Requiere amplificación Pequeñas cantidades de ARN Sensible

PCR en Tiempo Real: Pasos Aislamiento y Caracterización ARN Síntesis de cDNA Adquisición datos de Real Time PCR Generación de factores de normalización Datos normalizados Análisis de Datos

PCR en Tiempo Real PCR en tiempo real Aislamiento y Caracterización del ARN Muestra Extracción de ARN 28 S 18 S 5 S 28 S 18 S 5 S

Transcriptasa Reversa hace el cDNA complementario del RNA PCR en Tiempo Real PCR en tiempo real mRNA cDNA Retrovirus Transcriptasa Reversa hace el cDNA complementario del RNA

mRNA cDNA PCR en Tiempo Real PCR en tiempo real Transcripción Reversa (RT-PCR) OligodT se une al mARN mRNA cDNA Copia de la primera hebra de cDNA Digestión y desplazamiento del mARN Copia de la segunda hebra de cDNA

DETECCIÓN: AGENTES INTERCALANTES O SONDAS PCR en Tiempo Real DETECCIÓN: AGENTES INTERCALANTES O SONDAS ADN polimerasa termoestable Molécula de ADN (molde) Cebador sentido Cebador Antisentido Cofactor Mg2+ dNTPs (A;G;T;C)

PCR en tiempo real Métodos de Detección Agentes intercalantes Sondas de Hibridación

PCR en tiempo real Colorantes de unión al ADN: SYBR GREEN Unión al surco menor del ADN doble cadena. Emite fluorescencia cuando está unido al ADN doble cadena (dsADN). La intensidad de fluorescencia aumenta proporcionalmente a la concentración de dsADN.

PCR en tiempo real Colorantes de unión al ADN: SYBR GREEN No se unen de manera secuencia-específica, pueden generar falsos positivos. Se puede usar un colorante para evaluar varios genes. No se puede usar para reacciones en multiplex. Los diferentes productos de PCR se reflejan en la temperatura de melting (Tm).

PCR en tiempo real Sondas de Hibridación Se necesitan 2 primers y dos sondas específicas de secuencia. Las sondas se unen en un arreglo cabeza con cola. La primera sonda (upstream) está marcada con un fluoróforo donante (D) en el extremo 3´. La segunda sonda (downstream) está marcada con un fluoróforo aceptor (A) en el extremo 5´. Fluoróforo Donante Fluoróforo Aceptor

PCR en tiempo real Sondas de Hibridación Cuando se unen, los fluoróforos experimentan una transferencia de energía (FRET) del fluoróforo donante al aceptor con aumento de fluorescencia.

PCR en tiempo real Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man La sonda se hibrida con el amplicón blanco. Se encuentra bloqueada en el extremo 3´(fosforilada, no puede ser amplificado por la polimerasa). Tiene dos colorantes fluorescentes unidos (R= reportero y Q= quencher). El Q reduce la intensidad de fluorescencia del reportero cuando la sonda está intacta.

PCR en tiempo real Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man Método consiste de 2 primers y dos sonas específicas de secuencia. Sirve para evaluar múltiples genes con distintos colorantes (multiplex). Desnaturalización Pegado de primers y sondas Extensión por la ADN Polimerasa Extensión por la ADN Polimerasa y clivaje del Reportero Fluorescencia

PCR en tiempo real Molecular Beacons Es una sonda en horquilla. Tiene una región específica de secuencia flanqueada por dos repeticiones invertidas. Los fluoróforos reportero y quencher están unidos a los extremos, reduciendo la fluorescencia cuando está libre en solución. Cuando se unen a la secuencia, el Q y el R se separan, permitiendo la emisióm del R.

PCR en tiempo real Molecular Beacons Tienen mayor sensibilidad que las sondas lineares. Aplicación: Discriminación de alelos con fluoróforos distintos.

PCR en Tiempo Real

PCR en Tiempo Real El sistema de real time PCR se basa en la detección y cuantificación de un reportero fluorescente. Puede monitorearse la reacción de PCR en la fase exponencial. Se utilizan aparatos, placas y programas especiales para llevar a cabo la reacción y análisis de datos.

PCR en Tiempo Real Las reacciones se caracterizan por el punto en el tiempo (ciclo de PCR) donde la amplificación es detectada por primera vez: Ct o Cp. El Ct es el tiempo al cual la intensidad de fluorescencia es mayor que la fluorescencia de fondo (umbral de detección = threshold). Fase Exponencial Fase Plateau

PCR en Tiempo Real Cuanto mayor cantidad de ADN inicial, habrá un aumento más rápido de la señal fluorescente, resultando en un Ct más bajo.

PCR en Tiempo Real Cuantificación Absoluta Se determina la concentración de las muestras. Se necesita un estándar (ARN, ADN o cADN) cuya concentración se conozca con total exactitud. Se realiza una curva de diluciones con las concentraciones conocidas del estándar. Se intrapola el valor de Ct obtenido para conocer la concentración de ADN inicial de la muestra. Se utiliza para determinar la carga viral de una muestra.

PCR en Tiempo Real Cuantificación Relativa Se necesita un control interno o calibrador (housekeeping gene). Se determina cambios en el nivel de expresión de las muestras basados en una muestra de referencia o estándar. Se utiliza para comparar los niveles de expresión de un determinado gen en muestras diferentes (por ejemplo tratadas o no).

PCR tradicional vs. PCR en tiempo real

PCR en tiempo real Beneficios No requiere manipulación post-amplificación. Método muy sensible. Puede detectar una simple copia de un transcripto específico. Puede detectar diferencias de expresión menores al 23%. Requiere menos cantidad de RNA. Desventajas Requiere equipamiento y reactivos muy costosos. Debido a su alta sensibilidad, se necesita un correcto diseño experimental y técnicas de normalización para obtener conclusiones precisas.

PCR en tiempo real PCR en tiempo real Aplicaciones en Investigación DNA: Identificación de genes de virulencia o de resistencia a drogas. Genotipificación de cepas o subespecies Detección de mutaciones puntuales Estudio de de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) Cuantificación del número de copias por célula, o determinación de células iniciales en una muestra. RNA: Detección de la expresión de genes Efecto de mutaciones sobre la expresión Análisis de mRNAs variantes producidos por procesamiento diferencial Cuantificación de la expresión

PCR en tiempo real PCR en tiempo real Aplicaciones en Diagnóstico Clínico Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos: Virales (carga viral, carga pro-viral) Bacterianos Protozoarios Hongos Diagnóstico temprano (pacientes asintomáticos) Detección de genes de resistencia – mejor elección de terapia Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recaída) Detección de marcadores tumorales Estado del desarrollo / progresión de la enfermedad

LightCycler® SeptiFast Test MGRADE - Resultado en 6 horas Aplicaciones de la Real Time PCR en el diagnóstico de la sepsis neonatal LightCycler® SeptiFast Test MGRADE - Resultado en 6 horas - 1.5 ml de sangre - Sin incubación previa

Probe Tm E. Coli 52ºC P. Aeruginosa 57ºC

COBAS® AMPLICOR CT/NG Test (Roche ®) Aplicaciones de la Real Time PCR en el diagnóstico de la infección por C. Trachomatis y N. gonorrhoeae COBAS® AMPLICOR CT/NG Test (Roche ®) Test cualitativo para la detección de C. Trachomatis y N. gonorrhoeae Muestras: orina, hisopados endocervicales y uretrales 1) Amplificación de las secuencias blanco mediante Real Time PCR con cebadores específicos 2) Hibridación con sondas específicas para los dos agentes 3) Detección de los amplicones unidos a la sonda mediante una determinación colorimétrica

PREDICE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO ANTIVIRAL EN PACIENTES HCV + Aplicaciones de la Real Time PCR en la determinación de la variante del rs12979860 del gen IL28B PREDICE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO ANTIVIRAL EN PACIENTES HCV +