“Arrays de cDNA” Curso de Postgrado Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-06) Carles J. Ciudad. Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia Molecular. Fac Farmacia. UB. (cciudad@ub.edu)

Una Vieja Idea con una tecnología moderna Determinar la expresión génica a mRNA Un Array es un Multi-Northern Técnica basada en la hibridación Arrays (250-8000 genes), tamaño grande. Marcaje radiactivo Microrarrays (hasta 40,000 genes) micro. Marcaje fluorescente

APLICACIONES DE LOS ARRAYS DEFINIR PERFILES DE EXPRESIÓN GENICA (EN DIFERENTES TEJIDOS, ESTADOS DE DESARROLLO, TRATAMIENTOS: complementar funcionalmente el proyecto genoma humano) ESCRUTINIO DE MUCHOS GENES SIMULTÁNEAMENTE (ventajas respecto RT-PCR, RNAse protection, Northern analysis) INVESTIGAR PROCESOS NORMALES Y PATOLÓGICOS (comparación de tejidos) DESCUBRIR DIANAS TERAPÉUTICAS

PLATAFORMA BD-CLONTECH DISPOSICIÓN GENES

NATURALEZA DE LOS ARRAYS LO CONSTITUYEN CENTENARES DE cDNAs INMOBILIZADOS SOBRE MEMBRANAS DE NILÓN (8X12cm) CARGADAS POSITIVAMENTE (dup o singli) CADA cDNA CONTIENE 200-600bp, (10ng) (AMPLIFICADAS DE REGIONES DE mRNA SIN COLA DE POLI-A, ELEMENTOS REPETITIVOS O ALTAMEN-TE HOMÓLOGOS, Y QUE NO HIBRIDEN CON OTRAS SECUENCIAS DE GENES PRESENTES EN EL ARRAY) SON ESPECÍFICO DE ESPECIE CONTIENEN CONTROLES NEGATIVOS (PLÁSMIDOS,BACTERIOFAGOS), Y POSITIVOS (HOUSEKEEPING GENES) QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA NORMALIZAR

METODOLOGÍA d’ARRAYS - EXTRACCIÓN DE RNA (poliA o total) * comprobar la calidad - SÍNTESIS DEL cDNA Y MARCAJE * MMLV-RT * a-[32P]-dATP ó a-[33P]-dATP * Primers específicos (1176) - PURIFICACIÓN DE LA SONDA * sephadex G-50 - HIBRIDACIÓN * DNA inespecíficos * 68ºC OVN - LAVADOS * hasta 0,5 XSSC, 0,5% SDS - CONTACTAR CON PLACAS DE EUROPIO (días) - ANÁLISIS, NORMALIZACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

POLI A+ o RNA TOTAL

Normal vs Diabético (Arrays de 8000 genes)

NORMALIZACIÓN EN LOS ARRAYS LAS MEMBRANAS PUEDEN MOSTRAR DIFERENTES GRADOS DE HIBRIDACION DIFERENCIAS EN LA CALIDAD DEL RNA O EN LA SINTESIS DE LOS cDNAs NORMALIZACIÓN UTILIZANDO HOUSEKEEPING GENES NORMALIZACIÓN UTILIZANDO TODOS LOS GENES DEL ARRAY (GLOBAL NORMALIZATION)

CUANDO SE CONSIDERAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS ? GENERALMENTE CUANDO HAY DIFERENCIAS DE 2 o MAS VECES (INCLUSO MENOS DE 2 VECES EN EL CASO DE MENSAJES SOBRE-ABUNDANTES) EN EL CASO DE CAUSAR REDUCCIONES DE LA EXPRESIÓN (ALREDEDOR DE 0.5 VECES)

(Leucemia mieloide crónica) Genómica de la resistencia al MTX K562 (Leucemia mieloide crónica) HT29 (Cáncer de colon) I. Análisis genómico de los cambios de expresión II. Identificación de posibles dianas para el diseño de quimiosensibilizadores en la terapia con Metotrexato

Dosis respuesta al MTX en K562

CUANTIFICACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS CON ARRAYS

GeneSpring (Silicon Genetics/Agilent) 7.2

ARRAY SCATTERING.CNT

ARRAY SCATTERING.MTX

LIST-OVER 2

Clasificación Funcional

TREE-DOSE RESPONSE MTX

COMPROBACION DE LOS RESULTADOS RT-PCR CUANTITATIVO (En genes con diferencias de 2-5 veces >70% positivos; en superiores a 5 veces >90% positivos) NORTHERN ANALYSIS RNAse PROTECTION WESTERN ANALYSIS ANALISIS DE PROTEINAS EN 2D

Expresión de la IMPDH en células K562 tratadas con Mtx 24h Validación de los resultados por RT-PCR cuantitativa IMPDH2 APRT MTX (M) CNT 3x10-8 M 3x10-7 M 50 100 150 200 250 300 Niveles de mRNA para la IMPDH (% respecto el control)

Sonda Taq-Man

SÍNTESIS DE NUCLEÓTIDOS PÚRICOS ADENILSUCCINATO LIASA ADENILSUCCINATO SINTETASA ADENILSUCCINATO AMP IMP IMPDH XANTILATO GMP INHIBIDORES DE LA IMPDH O OH CONH2 BENZAMIDA RIBÓSIDO CH3 HO O O OH S N CONH2 TIAZOFURINA HO O O CH3O CH3 ACIDO MICOFENÓLICO

BENZAMIDA RIBÒSID BENZAMIDA RIBÒSID (M) CÈL.LULES RESISTENTS A 10-7 M DE MTX 2 4 6 8 1 C O N T R L - 7 M 3 X 5 BENZAMIDA RIBÒSID (M) + B

Plataforma ABI

ABI-Arrays

Equipo ABI

Plataforma Affymetrix

Arrays de Affymetrix (Alta densidad)

Ampliación Array Affymetrix

Arrays fotolitográficos

Detalles Técnica Array Affymetrix

Hibridación Array Affymetrix

Detección Array Affymetrix

Tipos de Arrays de Affymetrix

Types of Genome Microarrays by Affymetrix

GeneChips Human Genome Arrays

Detector Affymetrix

Microarray Affy HGU133A.2 (22.000 genes)

Microarray Affy HGU133A.2 (2-fold)

Microarray Affy HGU133A.2 Plus (Chromosome view-4 fold)

Curated pathways - Translation Factors

Microarray Affy HG U133A.2 plus (54.000 genes) (full genome)

Microarray Affy HGU133A.2 plus (4-fold)

4-fold list

DHFR

Software for curated pathways analysis and generation of BANs (Biological Association Networks)

For this example open Microsoft excel and enter the following gene symbols. Then copy this list. This is a list of genes that are differentially expressed based on microarray experiments

Build BAN

1. Find putative regulators 2. Set Filters Filter to include only expression regulation interactions

NLP (Natural Language Processing)

Common regulators AKR1C1

Sumario Estudios de Genómica Funcional para detectar dianas terapéuticas con que sensibilizar el tratamiento con Metotrexato Macroarrays (1,2K) ---> Microarrays con todo el Genoma (54K) Métodos de Deteción de Dianas: Listados de Genes Diferencialmente Expresados (GeneSpring) Clasificación por Gene Ontology (GO) Curated Pathways (KEGG, GeneMAPP, PathwayAssist) BANs (Biological Association Networks) (PathwayAssist, Ingenuity) Validaciones: RNA Proteína Actividad Funcionales: Inhibidores Químicos Moléculas Antisentido (Oligonucleótidos Antisentido, RNA interferencia)