SÓLO QUEDAN 5 SEMANAS

INGENIERIA GENETICA - BIOTECNOLOGIA

Anticuerpos Monoclonales . Marcadores Ingeniería Genética Tecnología del ADN Fármacos Anti-cáncer Diagnósticos Cultivo de Células Vegetales Transferencia de genes en animales Síntesis de Sondas de ADN Localización desórdenes genéticos Clonación Solución de crimenes BIOTECNOLOGÍA Producción de Proteínas humanas Terapia Génica Bancos de ADN, ARN Proteínas Mapas de Genomas completos Biología Molecular Cultivos Celulares Anticuerpos Monoclonales Síntesis de Nuevas Proteínas Nuevos Antibióticos Nuevas Plantas y Animales Alimentos Recursos humanos químicos raros BIOTECNOLOGÍA

Historia 1919: Karl Ereky, ingeniero húngaro, utiliza por primera vez la palabra biotecnología. 1953 James Watson y Francis Crick describen la estructura doble hélice de la molécula de ADN. 1965: El biólogo norteamericano R. W. Holley «leyó» por primera vez la información total de un gen de la levadura compuesta por 77 bases, lo que le valió el Premio Nobel. 1970: el científico estadounidense Har Gobind Khorana consiguió reconstruir en el laboratorio todo un gen. 1973: Se desarrolla la tecnología de recombinación del ADN por Stanley Cohen, de la Universidad de Stanford, y Herbert W. Boyer, de la Universidad de California, San Francisco.

Historia 1976: Har Gobind Khorana sintetiza una molécula de ácido nucleico compuesta por 206 bases. 1976: Robert Swanson y Dr. Herbert Boyer crean Genentech, la primera compañía de biotecnología. 1982: Se produce insulina para humanos, la primera droga derivada de la biotecnología. 1983: Se aprueban los alimentos trasgénicos producidos por Calgene. Es la primera vez que se autorizan alimentos transgénicos en Estados Unidos. 2003 Cincuenta años después del descubrimiento de la estructura del ADN, se completa la secuencia del genoma humano. 2004: La ONU y el Gobierno de Chile organizan el Primer Foro Global de Biotecnología, en la Ciudad de Concepción, Chile (2 al 5 de marzo)

Secuenciación DNA según Sanger

Secuenciación de DNA: Sanger

El genoma humano tiene una longitud de unos 3000 millones de pares de bases si la longitud media de cada fragmento es de 500 bases, llevaría un mínimo de seis millones de fragmentos secuenciar el genoma humano (sin tener en cuenta el solapamiento, es decir si fuera posible hacerlo de una sola vez). Mantener el control de un número tan elevado de secuencias presenta desafíos significativos que solo se pueden abordar mediante el desarrollo y la coordinación de varios algoritmos de procedimiento y computación

¿CÓMO SE ESTUDIABA TRADICIONALMENTE LOS PROCESOS BIOLÓGICOS?

Ultracentrífuga

Cromatografía en columna

Interacciones moleculares en cromatografía

Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS y b-mercaptoetanol

Electroforesis en gel de poliacrilamida

¿Qué es la ingeniería genética? La ingeniería genética consiste en la manipulación del material hereditario de un organismo para conseguir un objetivo práctico.

¿Qué es necesario para la técnica del ADN recombinante? Encimas de restricción. que son producidas por varios tipos de bacterias, reconocen secuencias específicas de ADN e interrumpen la doble cadena donde aparece dicha secuencia. Vector de transferencia. Es el agente que transfiere un segmento de ADN de un organismo a otro. Los mas utilizados son los plásmidos ADN ligasas. Son enzimas encargadas de unir el ADN. Célula hospedadora. Según el objetivo deseado puede ser una bacteria o una célula eucariota, generalmente levadura, vegetal o de mamífero.

Cortes por enzimas de restricción

Clonamiento en un plasmidio de un fragmento de DNA

Amplificación del plasmidio

Técnicas de ingeniería genética Clonación de ADN Síntesis de ADN complementario Obtención de ADN sintético Hibridación de ácidos nucleicos Genotecas de ADN PCR

CLONACIÓN DE ADN Aislamiento y obtención del gen: Fragmentación por endonucleasas de restricción → electroforesis → hibridación Síntesis de ADNc Obtención de ADN sintético Selección del vector: Plásmidos Virus: retrovirus Cromosomas artificiales (levaduras) YAC (yeast artificial chromsome): origen de replicación, centrómero, 2 telómeros y dos marcadores Plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens (vegetales) Formación de una molécula de ADNr Introducción en la célula hospedadora: Transformación (procariotas) Transducción Microinyección (óvulos fecundados) Electroporación (mamíferos y vegetales) Pistola de genes (animales y vegetales) Liposomas

HIBRIDACIÓN

SÍNTESIS DE ADNc

Obtención de ADN sintético Su preparación depende de la capacidad de bloquear selectivamente el extremo 3´ o el extremo 5´ de los nucleótidos; esto asegura que las reacciones de condensación que forman los enlaces azúcar-fosfato ocurran en la secuencia adecuada para unir los nucleótidos en el orden deseado.

VECTORES Plásmidos YAC

VECTORES Retrovirus

VECTORES Plásmido Ti

Formación ADNr

Introducción en la célula hospedadora

Introducción en la célula hospedadora

GENOTECAS

PCR (polimerase chain reaction) Para realizar la técnica se necesitan: Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Iones de magnesio (Mg 2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. Éste es un cofactor de la polimerasa. Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas. Se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a altas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). La más común es la Taq polimerasa). ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada paso del ciclo.

PCR (polimerase chain reaction) Ciclo de amplificación 1. Desnaturalización En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido), . generalmente calentando la muestra. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturación depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también de la longitud de la misma. Otros métodos, raramente empleados, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización. 2. Unión del cebador A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 ºC, aunque se puede variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC). Estos cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. 3. Extensión de la cadena Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 ºC (para la Taq Polimerasa), temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad, aumentando geométricamente la cantidad de fragmentos de ADN en la muestra. Este ciclo (desnaturalización-hibridación-extensión) se repetirá un número de veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee. Generalmente son 30 ciclos. Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservación.

Aplicaciones de la ingeniería genética Investigación: Mutagénesis dirigida. Sobreexpresión de proteínas celulares. Construcción de ADN artificiales. Estudios evolutivos. Estudios arqueológicos. Obtención de proteínas de mamíferos: insulina. Obtención de vacunas. Huellas dactilares de ADN. Diagnóstico de enfermedades genéticas. Terapia génica. Organismos transgénicos. Clonación de seres vivos. PGH.

Terapia génica

Terapia génica Corta vida media de la terapia: muerte prematura de las células modificadas, pérdida de la expresión del gen insertado… Respuesta inmune Problemas con los vectores virales Desórdenes genéticos: mutaciones, cáncer…

Referencias http://www.biotech.bioetica.org/clase2-3.htm (buena descripción de las principales técnicas) http://kimwootae.com.ne.kr/apbiology/chap13.htm (buenas imágenes, aunque está en coreano) http://blog.ayuda-hepatitis-c.es/que-es-el-pcr-reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa/ (explicación del PCR) http://www.cienciahoy.org.ar/hoy23/reaccion1.htm (hibridación y PCR)