Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales Departamento de Ciencias Biológicas Facultad de Ciencias Exactas Universidad Nacional de La Plata Calles 47 y 115, 1900 La Plata Tel.: (0221) int. 57

Utilización de fitoproteasas sobre proteínas lácteas Lazza, Cristian Martín; Pardo, Marcelo Fabián; Bruno, Mariela Anahí, Errasti, María Eugenia, Caffini, Néstor Oscar Direcciones electrónicas (Marcelo Pardo) (Cristian M. Lazza)

Desde su constitución en 1992, el LIProVe ha adquirido gran experiencia en el estudio de fitoproteasas, convirtiéndose en el principal grupo de investigación del país dedicado al tema. Se han aislado y caracterizado ya treinta fitoproteasas, logrando establecer la secuencia de algunas de ellas mediante secuenciamiento directo (Edman) o a partir del cDNA. Dado que en algunos casos la producción de proteasas es escasa, también se han desarrollado técnicas de cultivo in vitro para la producción de proteasas, así como de clonado y expresión de las mismas en levaduras. Las aplicaciones biotecnológicas de las nuevas enzimas comenzaron a desarrollarse casi simultáneamente con el aislamiento de éstas, en campos tales como la tecnología de alimentos, la industria del cuero y la síntesis en medio orgánico. El presente proyecto de investigación contempla el empleo de fitoproteasas aisladas en el LIPROVE en el tratamiento de proteínas lácteas bovinas

Aplicaciones de las proteasas Tiernización de carnes Elaboración de cerveza Elaboración de quesos Panificación Proteínas modificadas para la industria alimentaria Detergentes Manufactura de cueros Industria textil Industria farmacéutica Tratamiento de efluentes industriales

ACTIVIDADES DESARROLLADAS EN EL LIPROVE Aislamiento, Purificación y Caracterización de Fitoproteasas Aplicación de Fitoproteasas en: Tecnología de Alimentos Industria del Cuero Síntesis de Péptidos en Medio Orgánico Tratamiento de Efluentes Industriales Vinculación con el Sector Productivo en: Desarrollo de Procesos de Purificación de Proteasas

1. Determinación del poder coagulante y seguimiento de los productos de hidrólisis en el proceso de formación de quesos 2. Hidrólisis de las proteínas del suero para aprovechar desechos industriales 3. Obtención de péptidos bioactivos a partir de las fracciones caseínicas y de proteínas del lactosuero

Separación Isoeléctrica a pH 4.5 Leche en polvo descremada. (redisolución en AD a 11% p/v) o leche fluída, pH 6,6 Suero, pH 6.6 Precipitado Lavado y redisol. en BP 0.1 M Sobrenadan- te: Procesamien- to del suero Filtración y Centrifugación Centrifugación. Pellet µl Buffer Muestra para ELF 5 min de ebullición ESQUEMA GENERAL DE TRABAJO Ensayos de coagulación Ensayos de Hidrólisis con distintas proteasas Hidrólisis: 450 µl muestra + 50 µl enzima, a diferentes Temperaturas y tiempos. Reacción detenida por 500 µl of 5% TCA. SDS-Tricine – Gel Electrophoresis. Densitogramas por gel scanning. Procesamiento de datos. Análisis de péptidos por HPLC Manufactura de quesos Caseína 1% P/V en BP 0.1 M pH 6,6

Determinación del poder coagulante y seguimiento de los productos de hidrólisis en el proceso de formación de quesos El cuajo bovino es por excelencia el más apto para coagular la leche, aunque se han ensayado varios tipos de proteasas vegetales, animales y fúngicas como sustituyentes parciales o totales del mismo. En esta parte del trabajo se intenta establecer cuáles son las proteasas vegetales con la mejor relación coagulación- proteólisis. El tiempo de coagulación se determina por observación directa en tubo, los resultados obtenidos se comparan con los del cuajo bovino comercial (quimosina) y posteriormente se realiza el análisis electroforético (TRICINA-SDS-PAGE) de muestras de miniquesos durante el proceso de maduración. Queso tipo Holanda utilizando Onopordosina como coagulante

A B Las muestras de miniquesos se dejan madurar por 21 dias y luego se analizan. Miniquesos= A: utilizando quimosina como coagulante B: utilizando hieronimaina como coagulante. C: Densitograma correspondientes a la coagulación de leche de vaca por onopordaina D: Degradación parcial de las fracciones alfa y beta durante la coagulación de leche de cabra utilizando quimosina (  -Q y  -Q ) u onopordaina (  -O y  -O) como enzimas coagulantes Distancia relativa Intensidad de banda  -Q  -Q  -O  -O Area relativa de pico C D

Hidrólisis de las proteínas del suero para aprovechar desechos industriales En la elaboración del queso se produce suero como subproducto, que es rico en proteínas de elevado valor nutritivo. Respecto a la actividad proteolítica de las fitoproteasas sobre suero del queso, se realizaron ensayos con las distintas enzimas a fin de evaluar su capacidad de proteólisis sobre los sueros de los quesos obtenidos y mediante análisis electroforético se determinaron los perfiles proteicos correspondientes. Comparación por SDS-tricine- PAGE de las distintas fracciones obtenidas por procesamiento de la leche: 1 = patrón de PM, 2 = leche, 3 = suero, 4 = ß- lactoglobulina, 5 = caseínas, 6 = ß- caseína

Densitogramas de las fracciones obtenidas por coagulación de la leche con balanseína: 1 = Lactoferrina, 2 = Seroalbúmina bovina, 3 = Inmunoglobulinas, 4 =  s2 -caseína, 5 =  s1 -caseína, 6 = ß-caseína, 7 = ß-lactoglobulina, 8 =  - Lactalbúmina Densitogramas correspondientes a la hidrólisis de ß-lactoglobulina

Obtención de péptidos bioactivos a partir de las fracciones caseínicas y de proteínas del lactosuero Las proteínas lácteas son conocidas por tener importantes propiedades nutricionales, funcionales y biológicas. Son ingredientes importantes en alimentos funcionales promotores de la salud. Estas propiedades son parcialmente atribuidas a los péptidos bioactivos presentes en la estructura de las proteínas. Estos péptidos son inactivos dentro de la secuencia de la proteína intacta, y pueden ser liberados por la acción de diferentes enzimas proteolíticas. La importancia fisiológica de los péptidos bioactivos deriva de las siguientes propiedades hasta ahora descriptas: actividad opiode, acción antihipertensiva (inhibidores de la ECA), antitrombóticos, agentes inmunomodulatorios, transportadores de calcio (caseinofosfopeptidos) y actividad antimicrobiana.

El protocolo a emplear para la obtención de péptidos bioactivos consiste en: Preparación de extractos acuosos a partir de los hidrolizados de ambas fracciones. Fraccionamiento por exclusión molecular. HPLC en fase reversa o electroforesis capilar. Para la posterior identificación de los peptidos obtenidos se requerira de las siguientes metodologias: Degradación de Edman o EM en tandem para el secuenciamiento. Actividad potencial: se determina por comparación de secuencia con otros péptidos conocidos en bases de datos. Confirmación de actividad in vivo o in vitro requiere de cromatografía semi-preparativa para obtener material suficiente para los ensayos biológicos.