Clustering de Pixels basado en el Modelo El nivel de expresión de un gen es proporcional a las intensidades de los pixels de un spot. Los pixels de un artefacto, por ejemplo un “scratch”, tendrán intensidades distintas a los del background o foreground. De esto se desprende naturalente la clasificacion de los pixeles segun sus intensidades

Clustering de Pixels basado en el Modelo En clustering basado en el modelo, los datos de intensidades se consideran como provenientes de una mezcla de densidades: A partir del histograma de intensidades de un spot, parece natural considerarlo como una mezcla de normales. La funcion de verosimilitud es para los datos:

Histograma de intensidades de un spot

Para un K fijo los valores de Σ i, µ i y p i, pueden estimarse usando el algoritmo E-M jerárquico de clustering basado en el modelo (Dasgupta y Raftery, 1998). El numero de K puede ser estimado usando el BIC (Bayes information criterion). Para combinar ambas señales, se suman. En la mayoría de los casos se espera que el número de grupos, K, sea a lo sumo 3. Por eso, el BIC se restringe a K menor o igual a 3. – K = 1, no hay spot, es un blanco. – K = 2, hay un spot y el background. – K = 3, hay un spot, un artefacto o agujero interno y background.

Extracción del Componente Conectado Espacialmente Los artefactos, por lo general, se encuentran en grupos pequeños inconexos. Por este motivo, establecer una tamaño límite de componentes conectados en un cluster permite identificar clusters formados por artefactos. Para dividir a los clusters en componentes conectados espacialmente, se utiliza el procedimiento de etiquetado de los 4 componentes vecinos conectados (4-neighbor connected component labeling procedure). Por defecto, sólo se conservan los componentes conectados con un tamaño mayor a los 100 pixels, que representa la sexta parte del tamaño típico de un spot. Los clusters más brillantes y más oscuros que pasen el tamaño límite se clasifican como foreground y background, respectivamente. Si sólo un cluster pasa el tamaño límite, se concluye que no hay spot y que esa ubicación está en blanco.

Estimación de la Intensidad La estimación de la intensidad del foreground en el canal Cy3 es el promedio de los pixels en el cluster foreground. Lo mismo ocurre para el canal foreground Cy5, donde los mismos pixels están en el cluster para ambos canales. Las intensidades del background para los dos canales se estiman de la misma manera. Cuando se identifican 3 clusters, el cluster intermedio también se descarta, pues generalmente consiste en pixels “sospechosos, como por ej., un agujero interno, un artefacto, o un borde difuso. La señal estimada es: Is = If – Ib, donde If e Ib son las intensidades medias del foreground y background, respectivamente. La señal verdad es siempre >0, pero ocasionalmente, la señal estimada puede ser < 0. En este caso se asume que la intensidad verdadera es pequeña pero positiva, y se setea Is como el 5to percentil de las señales del spot en el arreglo.