Tema propuesto: Identificación de genes potenciales relacionados con el eflujo de membrana de Mycobacterium tuberculosis utilizando herramientas bioinformáticas.

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Transcripción de la presentación:

Tema propuesto: Identificación de genes potenciales relacionados con el eflujo de membrana de Mycobacterium tuberculosis utilizando herramientas bioinformáticas Título del Proyecto: Identificación de genes homólogos a EmrB (de Escherichia coli) como genes potenciales relacionados con el flujo de salida de Ácido Pirazinóico en Micobacterium tuberculosis

Introducción Introducción Taxonomía Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium. Descripción: aerobio obligado, no móvil, bacilo respomsable de tuberculosis. Número de membranas: 1 Presencia de flagelo: No Interacción: Patógeno animal en Mamíferos

Introducción PZA Pirazinamida Nicotinamida

PZA Introducción Resistencia: mutaciones en PZasa Monica Pajuelo Travezaño: Prodroga Enzima PZAsa Introducción PZA PZasa + H2O + NH4+ Resistencia: mutaciones en PZasa Resistencia: sin mutaciones y con actividad intacta

1. Mecanismo de acción de la PZA Antecedentes 1. Mecanismo de acción de la PZA

2. Resistencia a la PZA Antecedentes Mutación en PZasa ¿Bombas de flujo de salida involucradas? M. smegmatis: Tiene dos PZasas activas Frente a inhibidores de transportadores: reserpina, valinomicina, las cepas se hacen sensibles

Antecedentes 2. Resistencia a la PZA

3. Sistemas de flujo de salida de POA en M. tuberculosis Antecedentes 3. Sistemas de flujo de salida de POA en M. tuberculosis No hay estudios Schaller (2002) encontró EmrB y la proteína del mismo nombre que al mutar EmrB, E. coli se hacía ligeramente más resistente a POA Familia Major Facilitator Superfamily

Objetivos Objetivos Identificar genes homólogos a EmrB de E. coli relacionados con el flujo de salida de ácidos orgánicos débiles o de drogas en M. tuberculosis Verificar que los posibles genes contribuyan con el flujo de salida de POA en M. tuberculosis

Planteamiento del Experimento Uso de COG Búsqueda de genes homólogos a Emrb de E. coli Búsqueda en TubercuList Predicción de Segmentos Transmembrana Uso de TMpred Resultados Preliminares

Planteamiento del Experimento Recombinación genética homóloga Knockout de genes Acumulación de POA Uso de sustrato radiactivo marcado con C14 Determinación de la sensibilidad a PZA/POA Determinación de MIC Determinación de la actividad de PZasa Método de Wayne

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Búsqueda de genes homólogos a EmrB Planteamiento del Experimento Búsqueda de genes homólogos a EmrB Genes: M. tuberculosis: Rv1250 Rv1634 Rv2846c Rv0783c M. smegmatis: En el ORF finder del NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi: (515aa) contig:3563:m_smegmatis (from 2699490 to 2702857)

Motivo A: GRLADRFGRRRVLL Planteamiento del Experimento Motivo A: GRLADRFGRRRVLL

Planteamiento del Experimento

Planteamiento del Experimento

Knockout de los genes Planteamiento del Experimento Diseño de primers Res kana SacB Clonamiento en vector bomba Otros genes Recombinación Recombinación homóloga Recombinación no homóloga

Knockout de los genes Planteamiento del Experimento Células no recombinanates Recombinación no homóloga Recombinación homóloga Tratamiento con kanamicina Crecimiento en sucrosa

Acumulación de POA intracelular Planteamiento del Experimento Acumulación de POA intracelular Justificación: Verificar si el knockout del gen incrementa la acumulación de POA intracelular. Método: Marcaje con carbono radiactivo Principio:La acumulación de POA intracelular

Acumulación de POA intracelular Planteamiento del Experimento Acumulación de POA intracelular (14C)POA 1mCi/mL Incubar a 37°C hasta 24h Susp. de células Alícuotas de 50L / 30min Contador de Centelleo Filtrar al vacío

Planteamiento del Experimento Determinación de MIC Diluciones de PZA

Actividad PZasa Planteamiento del Experimento Justificación: Para comprobar que la enzima PZasa esté activa, si es que se tuviera una menor susceptibilidad a PZA. Método: Wayne Principio: Se detecta POA como producto de la acción de PZasa sobre PZA. El POA reacciona con sulfato de amonio ferroso, produciendo una coloración rosada.

Actividad PZasa Planteamiento del Experimento Sulfato de amonio ferroso 1% Incubar a 37°C por 4 días Dejar x 30min a T° ambiente Inocular el tubo

Planteamiento del Experimento