Agilent Technologies DNA Fish ID Solution

Identificación de pescados–Impacto en el mercado Métodos basados en Proteinas o DNA Uso para análisis de fraudes potenciales, mal etiquetado o casos de substitución eSpecies Legislación Sostenibilidad Industria Dirección de Cadena de suministro Traceability of products has become an important issue in any food related market In terms of fish this has two parts: Validation of species – is it the right fish/which fish is it at all Validation of origin – where was the fish caught Species authentication methods are well established. DNA based methods are the preferred method in the field due to their superior discrimination abilities Determining the origin of a fish sample is highly difficult and there is no general approach possible. Instead species specific solutions are available. Drivers behind testing are new legislations, the need of the industry to be compliant to regulations and also to manage/control their supply chains (mislabeling, substitution, fraud). Another driver is the customer who is willing to pay more for a more valuable (sustainable) product and is increasingly demanding to know what he or she eats. Consumidores Valor del producto, satisfacción del cliente

Métodos de identificación de pescados - Tradicional Morfologías Requiere expertos para la identificación Solamente aplicable a pescado total Métodos basados en proteínas El Procesado puede destruir proteinas. Polimorfismo limitado entre especies Dificultad de interpretación Influenciado por el medio ambiente Normalmente requiere correr muestrar autentificadas en paralelo Regulatory Fish Encyclopedia: U.S. Food and Drug Administration, 1993-2009 Methods for FishID can be based on Morphology: Trained expert needed, only applicable to whole fish Protein: Proteins are highly susceptible to processing. Heating, lots of salt, low pH (vinegar) affect proteins very easily Approved protein based methods usually require an authenticated sample to be run next to the unknown. Authenticated samples are hard to get. Interpretation of protein gels can be difficult and only a limited number of polymorphisms exist between species on a protein level

Métodos de identificación de pescados – DNA DNA métodos Resultados objetivos Más resistentes al procesado de muestras Fácil de utilizar Alta especificidad/sensibilidad Secuenciación Alta inversión incial (> 100K $) Alto coste de mantenimiento No aplicable con muestras mezcladas Métodos de elección para nuevas especies. DNA based methods are highly recommend in the field of species authentication DNA is more resistant to processing or long term storage than protein. Due to PCR even low starting amounts of sample can be analyzed and the analysis is highly specific Sequencing is the ultimate method for new species identification. This is usually done by either a service lab or with an in-house sequencing facility. Setting up your own sequencing comes with a high initial setup cost for the instrumentation (4-capillary sequencer ~100K USD$) and considerable maintenance costs. Sequencing does not work with mixed samples. PCR-RFLP allows discrimination of even highly related species and works with mixed samples. The method itself is a low cost, simple procedure. PCR-RFLP Discriminación entre especies sumamente relacionadas Trabaja con mezclas Bajo coste inicial

Método de identificación de pescados– PCR RFLP Mitocondrias: Alto número de copias Comunmente empleado el gen Cytochrome B (CytB) o Cytochrome Oxidase I (COX1) La secuencia del CytB aporta información para especies de pescados. Amplificar la región de interés en ADN Fragmentar el ADN para generar los modelos especificos Extraer el ADN PCR RFLP Food Control 16 (7), 601-607, (2004) http://www.chem.agilent.com/Library/ applications/5989-2982EN.pdf J Agric Food Chem 53 (9), 3388-3357 (2005) How does PCR RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) work: Target is usually a piece of DNA from the mitochondria or other organelles (eg. chloroplasts in plants) that are present in high numbers in a cell. The sequence for Cytochrome B has been used widely for this purpose, but other targets like Cytochrome Oxidase I are increasingly often used. For fish the available sequence data on CytB covers a large number of species. COX1 is not yet well covered, but used in the barcoding of life project. The method: DNA is isolated from a sample and the target sequence is amplified using PCR. The resulting product is then fragmented using enzymes that recognize specific sequences in the DNA generating a pattern of fragments. The combination of multiple of these patterns generated with different enzymes will create an overall pattern that is unique for a species. This method was transferred to the Bioanalyzer by Steve Garrett of Camden BRI (UK) and publications and application notes are available. Based on those many public analyst labs in the UK have adopted the method. La PCR RFLP es un metódo acreditado/aprobado en muchos países. Transferencia del método a 2100 Bioanalyzer para mejorar el análisis edición 2004 y 2005 por Stephen Garrett de Campden BRI (Reino Unido)

Agilent DNA Fish ID Solution El Agilent DNA Fish ID solution es un método simple, rápido y preciso basado en el screening del ADN para la identificación de diferentes especies de pescados frescos y procesados . Mejorar la calidad de los productos Reducir el impacto medio ambiental de actividades ilegales en la industria pesquera. Mantener los registros adecuados para el cumplimiento con las regulaciones gubernamentales. 

2100 Bioanalyzer VS Capillary Electrophoresis system gel electrophoresis tradicional 2100 Bioanalyzer Lab-on-a-chip system Preparar y correr el gel (1 - 3 h): Grandes volumenes de muestra necesarios  Preparación de los chips(5 - 15 min): Procedimiento simple para seguir el protocolo Bajo volumen de muestra (1 µl) Run y Detección (30 min): Alta sensiblidad (0.1 ng of DNA) Datos en formato digital Ticción, desteñido y adquisición de imagenes (0.5 – 1 h): Baja sensiblidad (>50 ng DNA)  Las imagenes necesitan ser digitaizadas Comparison of the Bioanalyzer based analysis against standard slab gel (precast or selfmade) Many labs are using slab gels either agarose gel or, more commonly, polyacrylamide gels for DNA fragment analysis. Overall the setup and run time for a slab gel exceed the time needed on the Bioanalyzer by far. In addition factors such as sensitivity (how much DNA do I need for detection), resolution (discrimination of two closely adjacent bands) and sizing accuracy are much in favor of the Bioanalyzer. Another major benefit is the automated data analysis performed with the 2100 Expert software Analisis: Analisis automatizado (tamaño y cuantificación) Comparación entre muestras y runs Alta resolución(5 bp diferencia) + precisión (± 10%) Analisis: Resolución restringida  Alta variabilidad de tamaño  No precisión cuantitativa  información Gel analisis < 1 h > 2 h

Agilent DNA Fish ID Solution - Generación de modelos de especies específicos Amplificación de secuencias de identificación de especies Purificación de la muestra < 1 h (dependiendo # muestras) ~ 1.5 h ~2.5 h Análisis de modelos usando el RFLP Decoder The workflow of the FishID kit is fast and simple. Molecular biology expertise is advantagous but not necessary. The whole protocol allows identification of fish species within one working day. ~ 6 h de muestra al resultado < 1 h (dependiendo de # muestras)

Paso 1: Extracción de ADN de tejidos en peces usando el Agilent DNA Fish ID Solution 1. Utilizar 40 mg – 1 g tejido (fresco, congelado, o procesado) Homogenización opcional 2. Digerir con Proteinasa K Digestion Buffer Incubar a 65oC for 10 min Total Time: 15 min 3. Obtener el ADN de la spin column 5 min 4. Lavar con High Salt Buffer (1X) Lavar con 80% Etanol (3X) 5. Eluir ADN < 1 hr del tejido al DNA Public April 15, 2017

Alto rendimiento de la variedad A de muestras de pescado Extracciones de variedades de especies de pescado Competitor Kits Agilent Kit Average 260/280: 1.41 Average 260/280: 2.09 Total yield, µg Total yield, µg Rango de rendimiento: 2-18 µg en 40 mg tejido Pureza: Media de 2.19 A260/A280 PCR Requerimientos: 0.5 – 500 ng Rendimiento en diferentes muestras alternativas (40 mg por muestra) 43µg DNA Yield, ug 6.6µg 3.7µg Public April 15, 2017

+ 1 µl Extracto ADN de pescado O Control positivo ADN de Salmon Step 2: PCR PCR Master Mix PCR Cycling 1.5-2 hrs Fish Primer Mix cytb PCR Amplicon + 1 µl Extracto ADN de pescado O Control positivo ADN de Salmon Public April 15, 2017

Validación de la amplifiación de diferentes especies de pescado Pacific Cod Dover Tilapia (farm) scallop Snapper Trout Tuna Atlantic salmon Swai Catfish Salmon (farm) Tilapia (wild) Public April 15, 2017

PCR: Amplificar con primers genéricos para peces Polymerase Chain Reaction (PCR) – Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) PCR: Amplificar con primers genéricos para peces PCR productos: “amplicon” Digerir con Enzyme A Digerir con Enzyme B Digerir con Enzyme C Muestra ADN SPECIES 2 SPECIES 1 ELECTROFORESIS Public April 15, 2017

Step 3: Digestión con Enzimas de restricción PCR Amplicon Digerir con DdeI Digerir con Hae III Digerir con Nla III (2 hr tiempo de digestión) Inactivar Enzimas con EDTA @ 65°C x 15 min Public April 15, 2017

Step 4: Bioanalyzer Lab-On-A-Chip Electrophoresis Preparar Fish ID Chip Añadir PCR-RFLP productos Correr muestra en el Agilent 2100 Bioanalyzer Analizar resultados A B C Seleccionar aplicación Click START <30 min run Cargar muestra ( 1 µL) Agitar 1 minuto Descongelar los reactivos Preparar gel/dye mix Public April 15, 2017

Digestión restrictiva de los amplicons de diferentes muestras de pescados Pacific Cod Dover Tilapia (farm) Snapper Trout Tuna Positive Control Swai Catfish Tilapia (wild) DdeI Hae III Nla III Public April 15, 2017

Interpretación de Resultados – RFLP Decoder Software Pattern 1 (Dde I) scoring panel Pattern 2 (Hae III) scoring panel Pattern 3 (Nla III) scoring panel Sample selection The dedicated analysis software allows even non-experts to identify a fish sample directly importing from a Bioanalyzer run. After sample selection individual patterns are matched against the supplied database. Scores indicate the quality of the individual match. All scores are combined into an overall score indicating the most likely species in the sample. The software will alert the user if a potential mixture is present and a corresponding analysis can be performed. The histogram pane visualizes the distribution of matches in the database allowing to gain confidence in the result by looking at the score separation of the best match to all other matches. Puntuación combinada: Indica la mayoría de las especies El valor de la Puntuación indica la calidad del emparejamiento. Histograma: La Separación de las principales especies de aquellas con menor puntuación ofrece una mayor confianza en el resultado. Public April 15, 2017

Paso 5: Coincidencia de modelos con el RFLP Decoder Software Entrada manual o Automatica de los productos digeridos Rangos de puntuación para cada enzima en relación a las especies La entrada manual por si tienes el bioanalizador acoplado a otro pc por ejemplo y tu metes los fragmentos a mano y sino de forma automatica el bioanalizador lo extrapola. Puntuación combinada de las 3 digestiones en relación a una especie. Public April 15, 2017

Coincidencia de patrones: RFLP Report Public April 15, 2017

Modelos de RFLP con mezclas de pescados Cod Haddock Mixture Limites de detección en mezclas: 5% Public April 15, 2017

Resumen de Agilent DNA Fish ID Solution Fácil de usar y simple Los Reactivos + Equipo+ software = Solución completa  Patrones de base de datos de especies específicas elimina la necesidad de autentificado de muestra en la misma prueba Resultados rápidos de un amplio rango de muestras De la muestra al resultado en un solio día de trabajo usando un protocolo simple Aplicable a pescados crudos, cocidos, ahumados, secos y salados Summary Resultados precisos y fiables Basados en un metodo fiable aprovado y acreditado en muchos paises. Base de datos ampliable por el usuario y teóricos perfiles de más de 200 especies.

Agilent DNA Fish ID Solution: Referencias: Agilent DNA Fish ID Ensemble - 5500-0100 Agilent DNA Isolation Kit - 5500-0051 Agilent PCR-RFLP Fish ID Kit - 5500-0001 Agilent DNA 1000 Kit - 5067-1504 Agilent RFLP Decoder Software, Fish - G5301A Agilent 2100 Bioanalyzer with chip priming station and IKA vortex mixer – G2939AA

Muchas gracias! HUGO_MINGO@AGILENT.COM AMPARO_DAVILA@AGILENT.COM