a-complementación Cepa E. coli LacZDM15 Expresión proteínas-BM 2009

Diseño de una estrategia para expresión de proteínas Elección del vector Aplicación u objetivos experimentales con la proteína expresada Información conocida de la proteína. Selección de la estrategia de clonado: solubilidad/localización subcelular/fusión a tags/regulación de la expresión. Preparación del vector corte con ER/desfosforilación/purificación Preparación del inserto de DNA plásmido y/o PCR/corte con ER/purificación Clonado del inserto dentro del vector Ligación/transformación en huesped/identificación. De clones positivos/verificación del producto clonado por secuenciación. Transformación dentro del huesped para expresión. Inducción y optimización de la expresión de la proteina de interés análisis cuantitativos de niveles de expresión y actividad biológica. Scale-up Purificaión de la proteína y análisis funcional 0-Expresión proteínas-BM 2009

Vel de crecimiento/ Costo Modificaciones post-traduccionales Sistemas de expresión de proteínas Sistema Vel de crecimiento/ Costo Nivel de expresión Modificaciones post-traduccionales E. coli 30 min. Bajo Alto NO Levaduras 90 min Medio  glicosilación Alta manosa Células insectos 18-24 hs.  glicosilación (largo, contenido manosa) Células mamíferos 24 hs Si 1-Expresión proteínas-BM 2009

Elección del sistema de expresión en E. coli Tamaño de la proteína: < 100 aminoácidos: estables como proteínas de fusión. >100 aminoácidos: inestables van a cuerpos de inclusión. Cuerpos de inclusión: agregados insolubles intracelulares. Ruptura células (sonicación)--- solubilización y refolding (Urea 8 M)---Diálisis 2) Cantidad de proteína: - Poca cantidad (screening de mutantes): plásmidos de expresión standard - Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de purificación. 3) Proteínas activas: considerar la formación de cuerpos de inclusión. 2-Expresión proteínas-BM 2009

Proteínas expresadas en E. coli 1) Proteínas de fusión: Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target. Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión purificación protege de proteólisis a la proteína de interés mejora la solubilidad de la proteína estabiliza a la proteína de interés ori Ampr ATG A B MCS Promotor Secuencia “tag”: *Dominio con función enzimática *Señales topogénicas Secuencias consenso para Corte con una proteasa Sitio múltiple de clonado Esquema genérico del vector 3-Expresión proteínas-BM 2009

Construcción de una proteína de fusión Fusion partner gene of interest MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... End ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG Nco I Note: translation stop of fusion partner gene must be removed Note: reading frame of fusion protein must be contiguous Secuencias consenso para el corte con una proteasa Clivan una secuencia corta y definida de aa La secuencia de clivado para la proteasa está entre el gen carrier y el gen de interés protease cleavage sequence fusion partner gene of interest 4-Expresión proteínas-BM 2009

Esquema general purificación de proteínas de fusión:GST 2- Glutation 1- 3- 4- Elution Corte con proteasa 5-Expresión proteínas-BM 2009

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Optimización de la expresión de proteínas en E. coli Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNA Se requiere optimizar la traducción. UAAGGAGG AUUCCUCC AUG 5’ 3’ mRNA 16S rRNA small ribosomal subunit Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a región en 16S rRNA (subunidad pequeña del ribosoma) Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG 7-Expresión proteínas-BM 2009

2) Uso de codones: El código genético es redundante, usa 61 codones para 20 aa. Los codones (excepto Met y Trp con 1 codón c/u) que codifican para un aa no son usados con igual frecuencia. Algunos codones usados infrecuentemente=↓[RNAt] Codon Aminoácido Frec. uso en E. coli Frec. uso en humanos GAG Glutámico 0,3 0,59 GAA 0,7 0,41 CCG Prolina 0,55 0,11 CCA 0,20 0,27 CCU 0,16 0,29 CCC 0,10 0,33 Cepa RosettaTM: cepa diseñada para aumentar la expresión de proteínas eucariotas que poseen codones de baja frecuencia en E.coli. 8-Expresión proteínas-BM 2009

Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNA 3) Estructura del mRNA: Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNA no debe ser complementaria a sí misma, podría bloquear el movimiento del ribosoma y evitar la traducción 4) Cepas deficientes en proteasas: Lon y OmpT 9-Expresión proteínas-BM 2009

Promotores basados en el operón Lac: Elección del promotor Promotores basados en el operón Lac: 1) Promotor Lac 10-Expresión proteínas-BM 2009

Lac promoter pGEM®-3Z Vector sequence reference points. T7 RNA polymerase transcription initiation site 1; multiple cloning region 5-61 SP6 RNA polymerase promoter (.17 to +3) 67-86; SP6 RNA polymerase transcription initiation site 69 lac operon sequences 94.323; 2564-2724 binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 104-125 lacZ start codon 108; lacZ operator 128-144 β-lactamase (Ampr) coding region 1265-2125 binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2677-2700 T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 2727-3 Cepa huesped: lacZDM15. Expresa LacIq 11-Expresión proteínas-BM 2009

Híbrido de promotores lac y trp Regulado por el represor lac 2) Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac Híbrido de promotores lac y trp Regulado por el represor lac Independiente de la regulación por cAMP XXXXXXXXXXXXXXXXXX -35 promotor trp -10 promotor lac Separación 16 pb=promotor tac 17 pb=promotor trc Gen de interés 12-Expresión proteínas-BM 2009

Ptac promoter : terminador de la transcripción Promotor Ptac/IPTG: Polylinker: MalE: secuencia señal de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP), periplásmica con alta afinidad por maltosa. 13-Expresión proteínas-BM 2009

El gen de interés puede estar bajo el control del promotor del gen 10 3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriófago T7: Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para expresarse Inducer T7 RNA Pol El gen de la T7 RNA Pol puede estar bajo el control del promotor lac en genómico de E.coli lac pro T7 RNA Pol Protein of Interest T7 RNA Pol El gen de interés puede estar bajo el control del promotor del gen 10 g10 pro gene of interest 14-Expresión proteínas-BM 2009

T7 promoter 15-Expresión proteínas-BM 2009

pRSET Expression Vector The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic expression controlled by the strong bacteriophage T7 promoter. Expression is induced by the production of T7 RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce basal expression of target genes. The pRSETvector offers: High-level expression from the bacteriophage T7 promoter T7 gene 10 sequence to provide protein stability N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond® resin N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the Anti-Xpress® Antibody Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and mutagenesis 18-Expresión proteínas-BM 2009

4) Promotores basados en el promotor del bacteriófago l pL: No tryptophan Transcription Ptrp PO lcI repressor lPL promoter- triptofano Bacterial Chromosome cI repressor No transcription PL PO ATG-GENE pLEX vector Tryptophan trp repressor No transcription Ptrp PO lcI repressor Bacterial Chromosome Transcription PL PO ATG-GENE pLEX vector Mechanism of transcriptional regulation with pLEX 17-Expresión proteínas-BM 2009

Sin actividad biológica. Contaminantes procarióticos. Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas: Inestables. Sin actividad biológica. Contaminantes procarióticos. Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas Esp. importantes para proteínas terapéuticas. Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y funcionales a la proteína natural. Modificaciones post-traduccionales Formación de uniones disulfuro correctas. Clivaje proteolítico del precursor inactivo. Glicosilación- agregado de residuos de azúcar Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación, agregado de grupos sulfato, agregado de ácidos grasos 19-Expresión proteínas-BM 2009

Levaduras como sistema de expresión Rápido crecimiento, bajo costo similar a E coli. Modificaciones postraduccionales escenciales para la función proteica. Problema (difieren de eucariotas superiores): forma de N-glicosilación y O-glicosilación: uso de levaduras con N-gycosilación humanizada. Saccharomyces cerevisiae Económico, bioseguro para aplicaciones humanos. Posee características bioquímicas, genéticas, similiar a eucariotas superiores. Es adaptable a fermentación gran escala. Herramienta para estudios de complementación. otros Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. 20-Expresión proteínas-BM 2009

YEp: episomales: ori 2m (alto número de copias) Vectores de levaduras Tipos de vectores YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma YEp: episomales: ori 2m (alto número de copias) YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél) Promotores Promoter Status Acid phosphatase PHO5 Inducible Alcohol dehydrogenase I ADH I Constitutive Alcohol dehydrogenase II ADH II Inducible Galctokinase GAL 1 Inducible Metallothionein Cup 1 Inducible Phosphoglycerate kinase PGK Constitutive Triose Phosphate isomerase TPI Constitutive 21-Expresión proteínas-BM 2009

Vectores centroméricos Vectores episomales Vectores centroméricos 22-Expresión proteínas-BM 2009

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Expresión de proteínas en Pichia pastoris Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae) Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular) Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento proteolítico. Kits de expresión disponibles. Empleo del gen AOX1 Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli AOX1p: promotor de alcohol oxidasa. AOX1t: secuencias terminador transcripción. MCS: sitio múltiple clonado. HIS4: marcador biosintético. 3´-AOX1 MCS Diagrama general de un vector P pastoris shuttle 24-Expresión proteínas-BM 2009

Integración del vector de P. pastoris Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión. Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.) Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos. Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas). Inserto Selección en medio his- Cepa resultante aox1=Muts Metanol: crec lento, alta producción prot. 25-Expresión proteínas-BM 2009

Pichia methanolica Expression System Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol oxidasa): reprimido por glicerol o glucosa Inducido por metanol a-factor: péptido señal para secreción de la proteína expresada. V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5 6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa. ADE2: marcador biosintético. 26-Expresión proteínas-BM 2009